表面等離子共振 (SPR) 技術(shù)與Biacore原理PPT課件.ppt

表面等離子共振 SPR 技術(shù)與Biacore原理 戴璐 表面等離子共振 SPR 原理 表面等離子共振 SurfacePlasmonResonance SPR 消逝波 當(dāng)光從光密介質(zhì)射入光疏介質(zhì) 入射角增大到某一角度 使折射角達到90 時 折射光將完全消失 而只剩下反射光 這種現(xiàn)象叫做全反射 當(dāng)以波動光學(xué)的角度來研究全反射時 人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達界面時并不是直接產(chǎn)生反射光 而是先透過光疏介質(zhì)約一個波長的深度 再沿界面流動約半個波長再返回光密介質(zhì) 則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波 CompanyLogo 2 表面等離子共振 SPR 原理 等離子波 把金屬表面的價電子看成是均勻正電荷背景下運動的電子氣體 其中正 負帶電粒子數(shù)目幾乎相等 這實際上也是一種等離子體 當(dāng)金屬受電磁干擾時 金屬內(nèi)部的電子密度分布會變得不均勻 因為庫侖力的存在 會將部分電子吸引到正電荷過剩的區(qū)域 被吸引的電子由于獲得動量 故不會在引力與斥力的平衡位置停下而向前運動一段距離 之后電子間存在的斥力會迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域 由此會形成一種整個電子系統(tǒng)的集體震蕩 而庫侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進行 進而形成的震蕩稱等離子震蕩 并以波的形式表現(xiàn) 稱為等離子波 CompanyLogo 3 表面等離子共振 SPR 原理 SPR光學(xué)原理 光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時 會形成消逝波進入到光疏介質(zhì)中 而在介質(zhì)中又存在一定的等離子波 當(dāng)兩波相遇時可能會發(fā)生共振 當(dāng)消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時 檢測到的反射光強會大幅度地減弱 能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子 入射光的大部分能量被表面等離子波吸收 使反射光的能量急劇減少 可以從反射光強響應(yīng)曲線看到一個最小的尖峰 此時對應(yīng)的入射光波長為共振波長 使反射光完全消失的入射角就是SPR角 SPR角隨金膜表面折射率變化而變化 而折射率的變化又與金膜表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比 因此可以通過對生物反應(yīng)過程中SPR角的動態(tài)變化獲取分子之間相互作用的特異信號 CompanyLogo 4 SPR生物傳感器 SPR生物傳感器的光源為偏振光 polarizedlight 傳感芯片 sensorchip 表面鍍有一層金膜 實驗時 先將一種生物分子 ligand 固定在金膜表面 然后將與之相互作用的分子 analyte 溶于溶液 或混合液 流過芯片表面 SPR檢測器能跟蹤溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合 解離整個過程的變化 不同角度的反射光的光強被記錄后得到角度 光強曲線圖 每條曲線的波谷即為該曲線的共振角 共振角對應(yīng)的角度為共振信號 resonancesignal 時間與對應(yīng)共振信號的曲線即為SPR傳感圖 sensorgram CompanyLogo 5 SPR生物傳感器 以免疫學(xué)分析為例 在金膜表面固定某種受體 如抗體 然后流過含相應(yīng)配體 如抗原 的樣品 配體與受體的結(jié)合將使金膜與溶液界面的折射率上升 從而導(dǎo)致共振角發(fā)生變化 為了表述的方便 共振角 或共振信號 可以用共振單位 resonanceunits RU 來表示 對大多數(shù)生物分子而言 1000RU大約等于1mm2的面積上有1ng的質(zhì)量變化 相當(dāng)于溶液中蛋白濃度為6mg ml SPR生物傳感器通過檢測獲得共振角的改變程度 便可以對配體濃度進行定量 CompanyLogo 6 SPR生物傳感技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域 生物大分子的相互作用 腫瘤研究免疫學(xué)和傳染病神經(jīng)科學(xué)生物制藥蛋白質(zhì)組學(xué) CompanyLogo 7 Biacore可研究的生物分子范圍 蛋白質(zhì)DNA RNA脂類 脂質(zhì)體 生物膜多糖多肽小分子全細胞 病毒 微生物 CompanyLogo 8 可分析的對象 CompanyLogo 9 Biacore核心組件 CompanyLogo 10 Biacore提供的生物分子相互作用信息 有無結(jié)合 YesorNo 結(jié)合的特異性和選擇性 Specificity 兩種分子的結(jié)合強度 親和力 Affinity 結(jié)合和解離的快慢和復(fù)合體的穩(wěn)定性 動力學(xué) Kinetics 功能復(fù)合體形成的參與者 協(xié)同者和組裝順序 Mechanism 分子結(jié)合的溫度與熱力學(xué)特征 Thermodynamics 目標分子活性含量的檢測 Concentration CompanyLogo 11 SPR光學(xué)組件 CompanyLogo 12 微流控系統(tǒng) IFC 集成化 自動化的微流路控制系統(tǒng)樣品消耗量低為互相作用分析而設(shè)計優(yōu)化 CompanyLogo 13 微流控系統(tǒng) IFC 流動池 IFC上有4個流動池可選擇單獨 配對 串聯(lián)使用 流動池為配對使用進行了優(yōu)化 Fc1 Fc2 Fc3 Fc4 CompanyLogo 14 傳感芯片 CompanyLogo 15 傳感芯片 CompanyLogo 16 葡聚糖表面 親水性溫和型 和2 濃度的葡聚糖水溶液環(huán)境相似非特異性結(jié)合量低高結(jié)合容量易于進行共價結(jié)合出色的化學(xué)穩(wěn)定性 CompanyLogo 17 傳感芯片的選擇 11種不同的芯片種類CM5 CM4 CM3 芯片 蛋白 肽段 小分子等CM7 小分子化合物研究SA芯片 生物素標記的分子 如核酸 糖類等BiotinCAP芯片 可逆性生物素捕獲芯片NTA芯片 His重組蛋白L1芯片 模擬脂質(zhì)雙分子層環(huán)境HPA芯片 實現(xiàn)膜系統(tǒng)相關(guān)的互作分析C1芯片 研究細胞 病毒等大顆粒分子Au裸金芯片 客戶定制表面 材料 高分子等 30余種不同的試劑盒及緩沖液產(chǎn)品 氨基偶聯(lián)試劑盒 巰基偶聯(lián)試劑盒 GST捕獲試劑盒GST重組蛋白分析 NTA捕獲試劑盒His重組蛋白分析 CompanyLogo 18 最常用的傳感芯片 CM5傳感芯片 CompanyLogo 19 Biacore實驗的基本流程 CompanyLogo 20 分析物和配體的定義 固定配體 Immobilization CompanyLogo 21 樣品進樣 Injection 分析物 Analyte 進樣后 以恒定的流速和濃度流過芯片表面樣品中的待分析物與固定在芯片表面上的配體發(fā)生結(jié)合 芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生改變 儀器記錄下對應(yīng)的響應(yīng)值 response 的改變進樣結(jié)束后 切換緩沖液流過芯片表面 分析物由配體上自發(fā)解離 解離的進程由響應(yīng)值實時監(jiān)控 CompanyLogo 22 芯片再生 Regeneration 將自發(fā)解離后仍然結(jié)合于配體的分析物徹底洗掉 配體的結(jié)合活性必須保留 CompanyLogo 23 傳感圖 TheSen