小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) InvivoMouseBoneMarrowCytogeneticsTestMicronuleusAssay 食品毒理學(xué) 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握哺乳動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)的原理和方法了解微核試驗(yàn)的意義及應(yīng)用 二 實(shí)驗(yàn)原理 微核 micronucleus 細(xì)胞主核之外 大小為細(xì)胞直徑1 20 1 5圓形或杏仁形 邊緣光滑整齊染色與主核一致一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以存在一個(gè)或多個(gè)微核 二 實(shí)驗(yàn)原理 微核成因染色體或染色單體的無著絲點(diǎn)斷片紡錘絲受損而丟失的整個(gè)染色體細(xì)胞分裂后期遺留在胞質(zhì)中 單獨(dú)形成規(guī)則的次核 植物細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 蠶豆根尖 淋巴細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)雙核微核實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn) 嗜多染紅細(xì)胞 PCE 嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞 由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個(gè)階段特點(diǎn) 1 無主核 易識別微核 有核細(xì)胞中微核與正常核葉及核的突起難以鑒別 2 胞內(nèi)含核糖體 染色后成灰藍(lán)色 區(qū)別于成熟紅細(xì)胞 其無核糖體 染色呈淡橘紅色 3 骨髓中PCE數(shù)量充足 滿足實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)的要求 三 意義及應(yīng)用 檢測化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn) 檢測能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物 DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑 輻射損傷 化學(xué)誘變劑 新藥試驗(yàn) 染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面 四 器材及試劑 器材 手術(shù)剪 無齒鑷 小型彎止血鉗 干凈紗布 帶橡皮頭吸管 晾片架 玻璃蠟筆 玻璃染色缸 載玻片及推片 定時(shí)鐘 帶油鏡頭顯微鏡 細(xì)胞計(jì)數(shù)器試劑 小牛血清 生理鹽水 Giemsa貯備液 五 操作步驟 實(shí)驗(yàn)動物的選擇及處理 動物選擇 大 小鼠 小鼠最常用 18 20g 7 12周齡 每組10只 雌雄各半 劑量選擇 以1 5LD50為最高劑量組 下設(shè)3 4個(gè)劑量組 同時(shí)設(shè)陽性和陰性對照 染毒途徑 經(jīng)口 經(jīng)皮 經(jīng)呼吸道 注射 染毒次數(shù) 多次染毒法 每天染毒一次 連續(xù)4天 第五天取樣 兩次染毒法 第一次染毒24h后進(jìn)行第二次染毒 6h取樣 五 操作步驟 本次實(shí)驗(yàn)染毒處理 環(huán)磷酰胺劑量 0 8mg 10g每次染毒 腹腔注射 次數(shù) 多次染毒法 4次 最佳濃度及作用時(shí)間 五 操作步驟 骨髓液制備 涂片 染色 觀察與計(jì)數(shù) 五 操作步驟 骨髓液制備及涂片猝死 頸椎脫臼 麻醉取組織 胸骨 股骨獲取骨髓液 在胎牛血清中迅速制取骨髓液涂片 均勻 五 操作步驟 染色涂片充分晾干后染色 1 平置涂片于染色架上 滴加試劑一5滴 迅速均勻蓋滿涂片 染色1 5min2 不要丟棄試劑一 直接滴加試劑二10滴 輕輕均勻搖晃涂片使染液均勻覆蓋涂片 染色8min3 水洗涂片30s 待干后鏡檢 五 操作步驟 觀察顯微鏡的使用低倍鏡 細(xì)胞群高倍鏡 分布均勻 染色良好油鏡 細(xì)胞形態(tài) 微核 觀察鏡下有3種細(xì)胞 PCE 灰藍(lán)色NCE 橘黃色有核細(xì)胞 藍(lán)紫色微核 藍(lán)紫色 圓形 邊緣規(guī)則 五 操作步驟 五 操作步驟 計(jì)數(shù)及結(jié)果分析1 總共200個(gè)細(xì)胞中 計(jì)數(shù)PCE與NCE的比值正常范圍0 6 1 2PCE NCE評價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)P值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 受試化學(xué)物劑量過大 PCE形成受到嚴(yán)重抑制 實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠2 微核率 含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù) 以千分率 表示 若一個(gè)PCE中出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上微核 仍按有一個(gè)微核細(xì)胞計(jì)數(shù) 3 陰性對照組和陽性對照組的微核發(fā)生率 根據(jù)實(shí)驗(yàn)對象的不同 應(yīng)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道或研究歷史數(shù)據(jù)相一致 4 統(tǒng)計(jì)分析 Poinsson分布 二項(xiàng)分布 X2檢驗(yàn)等 試驗(yàn)組微核率與陰性對照組相比有顯著差異時(shí) 可認(rèn)為受試物為具有遺傳毒性 骨髓微核觀察的步驟取胸骨擦凈血污 剔去肌肉剪去骨骺端小牛血清混勻 推片晾干Giemsa應(yīng)用液反面沖洗 晾干細(xì)胞計(jì)數(shù) 六 注意事項(xiàng) 骨髓液制備 迅速 在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片及染色 涂片均勻 防止細(xì)胞重疊染色層次分明 染液新鮮配制 pH 染色時(shí)間 鏡下觀察 認(rèn)真識別PCE和NCE正確區(qū)分微核和涂片上的雜物顯微鏡