蛋白質(zhì)和氨基酸的呈色反應(yīng).doc

實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)和氨基酸的呈色反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要聯(lián)接方式。2.了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3.學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法二、呈色反應(yīng)：(一)雙縮脫反應(yīng)：1.原理：尿素加熱至180左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測(cè)定。一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽部有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。2.試劑：(1)尿索： 10克(2)10%氫氧化鈉溶液 250毫升(3)1%硫酸銅溶液 60毫升(4)2卵清蛋白溶液 80毫升3.操作方法：取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開(kāi)始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10氫氧化鈉溶液約1毫升，振蕩混勻，再加1硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。避免添加過(guò)量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約l毫升和10氫氧化鈉溶液約2毫升，搖勻，再加1硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖，觀察紫玫色的出現(xiàn)。(二)茚三酮反應(yīng)1.原理：除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，1：1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。 茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分于和氨縮合生成有色物質(zhì)。 反應(yīng)機(jī)理如下：此反應(yīng)的適宜pH為57，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過(guò)大時(shí)甚至不顯色。2.試劑：(1)蛋白質(zhì)溶液 100毫升2卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液(蛋清：水1：9)(2)0.5甘氨酸溶液 80毫升(3)0.1茚三酮水溶液 50毫升(4)0.1茚三酮乙醇溶液 20毫升 3.操作方法： (1)取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱12分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。 (2)在一小塊濾紙上滴一滴0.5的甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴上一滴0.1的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。(三)黃色反應(yīng)：1.原理：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應(yīng)式如下：多數(shù)蛋白質(zhì)分子臺(tái)有帶苯壞的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。2.試劑：(1)雞蛋清溶液 100毫升將新鮮雞蛋的蛋清與水按1：20混勻，然后用六層紗布過(guò)濾。 (2)大豆提取液 100毫升將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀用紗布過(guò)濾。(3)頭發(fā) (4)指甲(5)0.5苯酚溶液 50毫升(6)濃硝酸 200毫升(7)0.3色氨酸溶液 10毫升(8)0.3酪氨酸溶液 10毫升(9)10氫氧化鈉溶液 100毫升3.操作方法：向7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。(四)乙醛酸反應(yīng)1.原理：在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì),反應(yīng)機(jī)理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。2.試劑：(1)蛋白質(zhì)溶液 100毫升 雞蛋清：水1：20(2)0.03色氨酸溶液 10毫升(3)冰醋酸 200毫升(4)濃硫酸(分析純) 100毫升3.操作方法： 取3支試管。編號(hào)。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶液、色氨酸