質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝的研究進展.doc

.綜述： 質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝的研究進展一、質(zhì)粒DNA細菌質(zhì)粒（plasmid）是存在于細胞質(zhì)中的一類獨立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成分，除了酵母的殺傷質(zhì)粒（killer plasmid）是一種RNA質(zhì)粒之外，迄今所知的所有質(zhì)粒無一例外地都是屬于這種類型的DNA分子1，質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代2，為了更好地適應(yīng)細胞的生理特點，質(zhì)粒主要以細長并具有負超螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在于原核細胞中3。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：超螺旋型（SC）質(zhì)粒DNA；開環(huán)型（OC）質(zhì)粒DNA和線性（L）質(zhì)粒DNA分子4。用于基因工程改造的質(zhì)粒載體通常包括復(fù)制子、選擇標(biāo)記和目的基因和啟動子5，為了獲得高穩(wěn)定性、高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA，在構(gòu)建質(zhì)粒DNA時，需仔細從以下幾個方面著手考慮。1. 質(zhì)粒復(fù)制子的選擇Prazeres6報道到2010年，以質(zhì)粒為核心的基因免疫和治療的市場產(chǎn)值將會超過450億美元，質(zhì)粒DNA的需求不斷加大。因此，無論從科學(xué)還是經(jīng)濟角度出發(fā)，在構(gòu)建DNA疫苗和基因治療用途的質(zhì)粒時，為了提高質(zhì)粒產(chǎn)量，復(fù)制子的選擇非常關(guān)鍵，目前，絕大多數(shù)學(xué)者選擇拷貝數(shù)高且僅需宿主編碼蛋白的ColE1復(fù)制子7。在攜帶ColE1復(fù)制子的質(zhì)粒中，RNAII是復(fù)制的正向調(diào)節(jié)分子，RNAI是復(fù)制的負調(diào)節(jié)物，另外，由質(zhì)粒編碼的一種Rop/Rom蛋白可提高RNAI與RNAII結(jié)合的效率，增強RNAI的負調(diào)控作用，因此，Rop/Rom基因缺失至少可使colE1質(zhì)粒拷貝數(shù)提高3至4倍8。Yavachev 和 Wang 9-10研究報道非荷載的轉(zhuǎn)移RNA的二氫尿嘧啶環(huán)、反義環(huán)和CCA序列可與RNA I或RNAII的環(huán)有高度的同源性，從而會影響到質(zhì)粒DNA的復(fù)制，但是其具體機制還有待進一步的研究。據(jù)Minton11報道，pUC19系列載體同樣被缺失了rop基因，但其與其他缺失rop基因的質(zhì)粒在拷貝數(shù)上的表現(xiàn)卻不盡相同，這是由于pUC質(zhì)粒在RNAII序列上帶有一個G到A的點突變，可依溫度的不同而改變正向調(diào)節(jié)分子RNAII的二級結(jié)構(gòu)，Chambers S &Yanisch-Perron C等研究表明在42或者45下，RNAII似乎折疊成抗RNAI抑制的構(gòu)型，于是DNA合成的起始加強，結(jié)果拷貝數(shù)特別高12-14。盡管構(gòu)建DNA疫苗時普遍使用ColE1類型復(fù)制子，但Uhlin B & Remaut E報道的一種由低拷貝發(fā)展而來的由溫度控制的“失控型”復(fù)制子同樣具有巨大的應(yīng)用前景，這種失控的質(zhì)?？墒官|(zhì)粒DNA大量積聚在大腸桿菌中，其拷貝數(shù)可以高達100015-16，Ansorge M和Chao Y證實這種拷貝數(shù)已成功地應(yīng)用來表達大量的重組蛋白17-18，盡管“失控型”復(fù)制子的優(yōu)勢非常明顯，但還沒有使用這個類型復(fù)制子來構(gòu)建DNA疫苗的成功例子，至今不清楚什么是導(dǎo)致此種復(fù)制子未得到開發(fā)的具體原因19。2. 抗性基因的選擇在選擇抗生素抗性基因時，由于極少量即可引起部分人群強烈的過敏反應(yīng)，首先應(yīng)避免-內(nèi)酰胺類抗生素的使用，而應(yīng)考慮氨基糖苷類的新霉素和卡那霉素20，因為這些氨基糖苷類的抗生素在臨床上很少使用，且無耳毒性、腎毒性等副作用，所以更為合適19。3. 其他元件的考慮設(shè)計、構(gòu)建DNA疫苗和基因治療質(zhì)粒載體的策略已經(jīng)十分明顯，它除了必須包括一個能使質(zhì)粒在大腸桿菌中維持、分裂的元件；一個能促使目的基因在機體內(nèi)表達的元件和選擇標(biāo)記外，還包括其他一些調(diào)控元件，以促使轉(zhuǎn)基因的表達和質(zhì)粒的穩(wěn)定21，這些元件包括真核啟動子、終止子及其終止信號等，啟動子是外源基因在動物細胞內(nèi)獲得表達的必要前提，常見的有CMVI/E、SV40、EF-1及UbC和MHCI等，CMV比SV4022和UbC23等更為有效，其中內(nèi)含子A更能提高CMVI/E的表達水平22，CMV現(xiàn)已被廣泛使用在商品化載體上，這對商業(yè)開發(fā)DNA疫苗來說是十分有幫助的。另外，一些抗原基因本身來源的啟動子也可用來構(gòu)建DNA疫苗，但對于想同時表達多個抗原基因的質(zhì)粒而言，此種啟動子的效果不明顯；常用的轉(zhuǎn)錄終止子及終止信號包括牛生長激素（BGH）、SV40及人-珠蛋白。此外，在構(gòu)建DNA疫苗時，可利用非甲基化的細菌DNA-CpG寡脫氧核苷酸來優(yōu)化整個質(zhì)粒，提高DNA疫苗的免疫原性，這是因為真核生物CpG的概率只有原核生物的1/16左右24，這種頻率上的差異使得其與模式識別受體TLR-9的相互作用，提高了免疫應(yīng)答水平25。4. 目的基因在選擇和構(gòu)建質(zhì)粒DNA時，首先應(yīng)考慮的是質(zhì)粒DNA可否整合入宿主基因組，因此，在選擇目的基因時，須嚴格避免目的基因同人類基因組之間具有長片斷的同源序列；啟動子和終止子同樣須認真篩選以嚴格控制其生物學(xué)活性；此外所有構(gòu)建質(zhì)粒DNA的過程需要有詳細的記錄，且附有基因的序列，宿主菌的表型和基因型鑒定26-32。5. 質(zhì)粒的穩(wěn)定性質(zhì)粒DNA導(dǎo)入宿主細胞后，必將引起宿主菌生理發(fā)生改變33，質(zhì)粒的復(fù)制增加了宿主菌的負擔(dān)，引起宿主菌生長速率下降，使得重組工程菌的發(fā)酵過程比非重組菌的發(fā)酵過程復(fù)雜化，進而有可能降低質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性；同時，外源基因的插入也會干擾到質(zhì)粒本身的穩(wěn)定性，在以大腸桿菌為宿主的發(fā)酵過程，還必須考慮到宿主菌的遺傳特性34-36，判定其是否存在可以降解重組DNA，或者產(chǎn)生引起重組DNA的不穩(wěn)定性的蛋白酶或其他一些蛋白分子。5.1 質(zhì)粒不穩(wěn)定性的概念質(zhì)粒不穩(wěn)定性，是指工程菌在生長過程中重組質(zhì)粒發(fā)生變化，結(jié)果不呈現(xiàn)原有的表型特征。質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為兩類：分離不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性37。分離不穩(wěn)定是指在細胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部質(zhì)粒的丟失；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定則是由于重組質(zhì)粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，質(zhì)粒的分配不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的結(jié)果都將使我們得不到預(yù)期的質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量。如果發(fā)生質(zhì)粒分離不穩(wěn)定，由于部分重組質(zhì)粒的丟失，工程菌的發(fā)酵過程實際上是工程菌和不含有質(zhì)粒的宿主菌的混合培養(yǎng)，Imanaka38證實在非選擇性條件下，含有重組質(zhì)粒的工程菌的比生長速率（+）往往小于宿主細胞的比生長速率(-)，經(jīng)過25代后，培養(yǎng)液中幾乎都是無質(zhì)粒的細胞。5.2 質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)是體現(xiàn)質(zhì)粒穩(wěn)定性的一個重要特征，拷貝數(shù)首先決定于自身的遺傳特性，同時也受到宿主菌生理狀況及生長環(huán)境的影響，Enberg & Nordstorm39研究認為宿主菌生長速率增大，質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降，這可能是高比生長速率下，質(zhì)粒的復(fù)制速度跟不上細胞分裂的速度，從而質(zhì)?？截悢?shù)不斷下降。此外，Koizumi40的研究同樣證實了營養(yǎng)物質(zhì)的限制或缺乏也會導(dǎo)致質(zhì)粒拷貝數(shù)的下降。一般來講，質(zhì)?？截悢?shù)對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響因質(zhì)粒的不同而不同，F(xiàn)utcher & Cox41對幾種質(zhì)粒的穩(wěn)定性進行了研究，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒穩(wěn)定性隨著拷貝數(shù)的增大而增加，但當(dāng)質(zhì)?？截悢?shù)太高時，質(zhì)粒也往往不穩(wěn)定，因多次復(fù)制，增加了出差錯的機會。5.3 培養(yǎng)方式對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響培養(yǎng)基對質(zhì)粒的穩(wěn)定性也起著非常重要的作用，Caulcott 42研究表明質(zhì)粒在以葡萄糖作為碳源時的丟失頻率大于以淀粉為碳源的培養(yǎng)基。低溫往往有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定地遺傳，而當(dāng)溫度高于50時，重組質(zhì)粒在分批培養(yǎng)的對數(shù)后期和連續(xù)培養(yǎng)時均呈現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定狀態(tài)43。5.4 解決辦法在重組基因工程菌發(fā)酵過程中，克服質(zhì)粒丟失的最廣泛使用也是最有效的方法就是添加針對抗性基因的抗生素。FDA規(guī)定不管在生產(chǎn)還是管理上都應(yīng)用卡那霉素代替氨芐青霉素，其原因是考慮到內(nèi)酰胺類抗生素是一種強烈的過敏原；另外，用抗生素添加法來消除質(zhì)粒脫落性的不穩(wěn)定性在大規(guī)模生產(chǎn)時并不可取，因為這種選擇壓力只能維持一段時間，要從根本上解決這個問題，需要研究影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的各個過程（質(zhì)粒的復(fù)制、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移及質(zhì)粒在子代細胞中的分配等）44；此外，質(zhì)粒的平衡致死系統(tǒng)有可能為徹底摒棄抗生素的使用奠定基礎(chǔ)45。二、菌種庫的建立對轉(zhuǎn)化大腸桿菌的條件進行優(yōu)化。建立原始種子庫。分析種子庫的遺傳穩(wěn)定性，要明確該種子庫可以傳代的次數(shù)。在此基礎(chǔ)上建立主細胞庫和工作細胞庫，并應(yīng)保證該類細胞庫沒有噬菌體和其它外源因子的污染；并對細菌的遺傳背景進行分析和檢測，保證細胞庫中細菌的遺傳背景包括基因型、表型未發(fā)生改變；應(yīng)檢測細菌的形態(tài)學(xué)，保證細菌的均一性；應(yīng)檢測導(dǎo)入基因的存在狀態(tài)。并對工作細胞庫的規(guī)模、保存條件、擴增條件、傳代過程中質(zhì)粒的穩(wěn)定性（拷貝數(shù)及表達量）、允許的傳代次數(shù)等進行研究。三、含重組質(zhì)?；蚬こ叹陌l(fā)酵影響質(zhì)粒 DNA 產(chǎn)量的因素最重要的是宿主菌株的遺傳背景和質(zhì)粒分子本身的拷貝數(shù)，除此之外，在工業(yè)發(fā)酵中宿主菌株的生長條件和培養(yǎng)基類型也是不可忽視的條件。一般建議使用 endA 基因發(fā)生突變的（endA1）大腸桿菌宿主菌株，例如 DH5，JM109，以及 XL1-Blue 等，因為 endA 基因突變的結(jié)果，使得大腸桿菌宿主細胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶的能力，從而增進了所含質(zhì)粒 DNA 分子的穩(wěn)定性46。在典型的分子生物學(xué)實驗中，質(zhì)粒是由大腸桿菌在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)的，溫度、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基是唯一可控制的因素47。一般培養(yǎng)物的質(zhì)粒產(chǎn)量在 1-10mg 之間；在高密度培養(yǎng)的發(fā)酵罐中，諸如培養(yǎng)基組成、溫度、pH 值、溶解氧、積累的代謝產(chǎn)物，攪拌速度等影響細菌及質(zhì)粒產(chǎn)量的因素都能得到監(jiān)測和控制，質(zhì)粒產(chǎn)量可達搖瓶的10到50倍48，Lahijani R49的研究數(shù)據(jù)顯示每升培養(yǎng)基可以產(chǎn)出220mg質(zhì)粒DNA，Schmidt T50也表明質(zhì)粒產(chǎn)量可達225mg/L。高密度培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，不僅能增加產(chǎn)率，而且也為減少發(fā)酵罐容積、減輕分離純化、減少污水、降低能耗和成本帶來好處。3.1 培養(yǎng)基的組成大腸桿菌可以在營養(yǎng)豐富或貧乏的培養(yǎng)基中生長，但是營養(yǎng)物的種類及來源對質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和數(shù)量都產(chǎn)生重大影響51。由于可生產(chǎn)高的細胞密度，豐富的、復(fù)合培養(yǎng)物，如酵母膏和/或蛋白水解物很受歡迎，肉膏因為可能含有瘋牛病等動物病毒而成為潛在的污染源被排除在外。除了豐富營養(yǎng)物，還需加入葡萄糖或甘油等碳源物質(zhì)，Korz52研究表明，以甘油為基礎(chǔ)的碳源培養(yǎng)基的生長速度較慢，幾乎不產(chǎn)生乙酸，終產(chǎn)物也比以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基多，但當(dāng)它們超過一定的范圍時都會阻止細胞的生長，這就解釋了為什么在間歇發(fā)酵中增加營養(yǎng)物的濃度并不能得到高細胞密度的原因。目前，常用的有三種形式的培養(yǎng)基：限制性培養(yǎng)基、半限制性培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基，其可重復(fù)性依次降低。OKennedy53的研究結(jié)果表明，半限制性培養(yǎng)基生產(chǎn)質(zhì)粒pSV的產(chǎn)量為9.12g/mg干菌，比復(fù)合培養(yǎng)基的4-6g/mg干菌高一些。同時， OKennedy54還證實了用于質(zhì)粒生產(chǎn)培養(yǎng)基最佳的CN為2.781，最大比例不要超過121，因為在此范圍內(nèi)，細菌膜上的肽聚糖的成分沒有發(fā)生改變，不會影響到化學(xué)裂解的特性，在試驗過程中，OKennedy還發(fā)現(xiàn)添加氨基酸后的限制性培養(yǎng)基SDCAS，無論在提高質(zhì)粒超螺旋的比例上還是在減少質(zhì)粒的丟失率上都比LB培養(yǎng)基的效果好，且SDCAS經(jīng)堿裂解后產(chǎn)生的宿主基因組DNA也明顯減少。3.2 發(fā)酵方式的選擇發(fā)酵一般以分批或者流加的方式進行55。在這兩種方式中，流加發(fā)酵可以提高細胞密度，并因此可能改變質(zhì)粒的質(zhì)量，Matsui56報道在發(fā)酵過程中添加固體葡萄糖，可以使DCW(dry cell weight)達到134g/L，質(zhì)粒在細胞中一般呈現(xiàn)負超螺旋結(jié)構(gòu)，但據(jù)了解，宿主菌的生長條件，溶解氧及溫度等的改變都可以改變超螺旋質(zhì)粒的密度57。D.J.Korz58研究證實，溶氧不足或CO2過剩都會促進乙酸形成，促使細胞衰老和死亡，降低質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。Lahijani59 探討了溫度和流加操作對質(zhì)粒產(chǎn)量的影響，培養(yǎng)物在連續(xù)流加操作中保持 37直至 OD600達到某個數(shù)值后，升溫至 42或 45，這樣可大大提高質(zhì)粒的產(chǎn)量，補料過程中，可盡量使用氨水來調(diào)節(jié)pH，這樣可以補充氮源。也有實驗指出質(zhì)粒的生產(chǎn)因為質(zhì)粒本身而異，相同發(fā)酵條件下不同的質(zhì)粒產(chǎn)量會有很大差異；但多數(shù)研究者認為，控制細菌較低的比生長速率，對質(zhì)粒的復(fù)制有很大的好處，因為，宿主菌過快的直接后果是質(zhì)粒復(fù)制跟不上細菌的生長，導(dǎo)致拷貝數(shù)下降或者質(zhì)粒丟失。理想的質(zhì)粒收獲階段應(yīng)該是在細菌生長進入生長對數(shù)后期或靜止期前期，此時RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯的水平處于最低，質(zhì)粒的復(fù)制達到最高水平。1989年，Reinikainen 60研究小組得出結(jié)論，pH值介于6.2-6.8之間和30的培養(yǎng)溫度有利于ColE1類型復(fù)制子質(zhì)粒產(chǎn)量的提高，此外，添加氯霉素61，氨基酸饑餓62，添加痕量維生素63等都可以提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。四、質(zhì)粒的分離和純化在質(zhì)粒的最終產(chǎn)物中，宿主基因組片段、高分子量的RNA尤其是核糖體RNA和質(zhì)粒的異構(gòu)體不利于質(zhì)粒的基因轉(zhuǎn)染，因此，如何有效消除這些雜質(zhì)尤為關(guān)鍵。因為質(zhì)粒DNA的這種帶負電荷的多形結(jié)構(gòu)使得它的電荷性和親水性能夠與許多分子如內(nèi)毒素和雜蛋白相結(jié)合，加大了其純化的難度，雖然目前有很多種方法可用來純化質(zhì)粒DNA，但迄今并沒有一個相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。在實驗室未優(yōu)化的條件下，質(zhì)粒產(chǎn)量通常較低，且提取和制備的質(zhì)粒DNA損失嚴重，不符合FDA等相關(guān)組織機構(gòu)的條例。除此之外，質(zhì)粒的大規(guī)模提取要考慮到如何降低生產(chǎn)成本，并按照生物制品評價和研究中心（Center for Biologics Evaluation and Rrsearch, CBER）下屬的疫苗研究和管理辦公室已有的章程嚴格執(zhí)行 64。如前所述，質(zhì)粒純化時，主要考慮四種雜質(zhì)：gDNA，RNA，蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。質(zhì)粒的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)除了要除去這些雜質(zhì)之外，還應(yīng)該避免使用有毒，有機、易燃試劑和動物源性的酶試劑65。在保證產(chǎn)率和純度合格的情況下應(yīng)選擇省時、省成本、省純化工藝的操作流程。所有的操作都應(yīng)該能夠放大到每批生產(chǎn)克級甚至千克級的質(zhì)粒。最重要的是，所有過程要有重復(fù)性，這樣才能使生產(chǎn)出的質(zhì)粒一直符合產(chǎn)品規(guī)格。一般的，質(zhì)粒的大規(guī)模純化包括下面幾個或所有步驟：細胞裂解，沉淀，酶消化，柱層析（一步或多步），脫鹽或著改變緩沖液，以及無菌過濾。質(zhì)粒的大規(guī)模生產(chǎn)純化的大致流程如下圖所示66：4.1 細胞收集細胞培養(yǎng)結(jié)束后，必須通過連續(xù)流或者微過濾67對培養(yǎng)菌體進行濃縮，這不僅僅是要對菌體進行濃縮，而且是為了去除對接下來的純化有影響的培養(yǎng)基成分。4.2 細胞裂解細菌細胞裂解是純化流程中的關(guān)鍵一步?？梢酝ㄟ^多種手段來完成細胞的破碎：機械破碎（珠磨法、滲透壓沖擊等），酶解法，熱裂解和堿裂解法。4.2.1 機械裂解關(guān)于機械破碎裂解大腸桿菌以釋放質(zhì)粒的研究表明只有微流體化和珠磨法能獲得完整的質(zhì)粒分子。當(dāng)用微流化器破碎細胞達65時，質(zhì)粒最多可以回收35，而用玻璃珠研磨破碎細胞達50時質(zhì)粒分子最多可以回收達74，用微流化和玻璃珠研磨破碎細胞后，超螺旋質(zhì)粒在總釋放質(zhì)粒中分別為80和94，增加細胞破碎頻率將使超螺旋質(zhì)粒減少至10以下68，絕大多數(shù)質(zhì)粒呈現(xiàn)“smear”形狀，為獲得相對產(chǎn)量較高的超螺旋質(zhì)粒必須降低細胞破碎率，因此，在規(guī)模化生產(chǎn)上，這些破碎方法并不適用。4.2.2 熱裂解Zhijun Wang69等研究認為熱裂解具有不需完全破裂細胞、價格低廉、操作簡便快捷等諸多優(yōu)點，其所需設(shè)備一般有蠕動泵、去污劑和循環(huán)熱水浴等，但是我們的熱裂解實驗結(jié)果表明：靠蠕動泵將懸浮在Triton、EDTA中的菌液循環(huán)于沸水浴一段時間后，得到的菌液粘度太大，不易下一步操作，且含有的宿主基因組DNA太多，因此我們放棄了進一步的嘗試。4.2.3 堿裂解目前最受歡迎的細胞裂解法是由 Birnboim & Doly70提出的堿裂解法，它主要是靠0.2M NaOH、 1%SDS和pH4.8的KAC來完成的，它的整個步驟包括我們常說的SolutionI、SolutionII、SolutionIII三步，首先是將菌體懸浮在SolutionI中，其中的EDTA比較關(guān)鍵，它起著兩個作用：（1）鰲合細胞膜和骨架上的Ca2+、Mg2+，從而使細胞更易破碎（2）鰲合Mg2+，使得內(nèi)源性DNase沒有Mg2+不能發(fā)揮作用，保持質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性，另外SolutionI中的Tris起著穩(wěn)定pH的作用，葡萄糖起著緩沖防止gDNA斷裂的作用。SolutionII是非常關(guān)鍵的一步，SDS破壞胞膜，釋放菌體內(nèi)容物，同時也能使絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)和脂肪變性并溶解，NaOH使質(zhì)粒DNA和基因組DNA都變性，而質(zhì)粒DNA由于有特有的拓撲超螺旋結(jié)構(gòu)，可以在下一步中自然復(fù)性，而基因組DNA則永久變性，在這一步中注意事項是在混勻過程中動作必須輕柔，原因是防止局部pH大于13而導(dǎo)致質(zhì)粒DNA不可逆變性和粗暴操作導(dǎo)致的基因組斷裂，局部高濃度的SDS也會形成鬼帶（ghoast band）71。接下來的是用SolutionIII進行中和，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，同時高濃度的KAC也起到了鹽析的作用，最終形成的SDS-gDNA-蛋白不可溶復(fù)合物而被去除，這一步使得變性的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)變成不溶的，凝乳狀的沉淀，同時一部分染色體 DNA也沉淀出來，而質(zhì)粒 DNA 仍然呈溶解狀態(tài)。這是因為染色體 DNA 和一些蛋白質(zhì)及脂質(zhì)是部分相連的，而質(zhì)粒通常沒有這種連接狀態(tài)。在最終的沉淀步驟，考慮到質(zhì)粒DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是由兩條帶磷酸基的骨架構(gòu)成，存在著互相排斥的可能性，所有可以在其中加入一些NaCl和NaAC等使得DNA更易沉淀，天氣炎熱時還可降低溫度，以抵消布朗運動效應(yīng)帶來的質(zhì)粒不易沉淀的后果。由于SolutionIII中KAC的成本非常昂貴，為了降低生產(chǎn)成本，我們根據(jù)溶液III的原理，摸索了許多種新配方，同樣也能達到相似的效果，成本卻大大降低，為大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA提供了有力的保證。4.2.4 苯酚、氯仿直接抽提法1999年，Jun Song72等人報道了用苯酚和氯仿直接抽提培養(yǎng)菌液來獲得質(zhì)粒DNA的技術(shù)，這項技術(shù)可以大大節(jié)約質(zhì)粒提取的時間，尤其體現(xiàn)在通量篩選重組克隆時優(yōu)勢明顯，但其不能去除宿主基因組DNA。4.3 質(zhì)粒制備液的凈化和濃縮在實驗室水平上，去除細胞碎片、變性蛋白和核酸沉淀物的辦法通常是離心。然而，這并不適用于質(zhì)粒DNA 的工業(yè)化生產(chǎn)。在工業(yè)操作中，這應(yīng)該由被證明是產(chǎn)生剪切力低的操作來完成。這是因為：第一，應(yīng)避免將染色體 DNA 剪切成片段，否則染色體 DNA 將從沉淀中釋放并污染質(zhì)粒；第二，質(zhì)粒在分離過程中也要受到剪切，如果質(zhì)粒分子較大，則可能發(fā)生分子鏈的斷裂。工業(yè)上的離心機通常采用連續(xù)流加方式操作以達到高的處理量。進入離心機的流體所產(chǎn)生的離心加速度可能導(dǎo)致剪切，從而打散已經(jīng)沉淀的物質(zhì)和 gDNA。因此，過濾成為比較理想的操作，但是如何防止粘稠的沉淀復(fù)合物不堵住過濾孔還是一個復(fù)雜的技術(shù)難題。 質(zhì)粒 DNA在大腸桿菌裂解液中只占總核酸的 1%(w/w)73，裂解后，仍然存在大量的 RNA 和蛋白質(zhì)，這些都必須在隨后的步驟中被去除，同時應(yīng)該降低溶液的體積以便于后續(xù)操作。通常的處理方法是過柱法，包括離子交換74、分子排阻75、疏水層析76、三鏈DNA親和層析77；或者通過加入無水乙醇、異丙醇來達到濃縮質(zhì)粒DNA的目的，但無論是前者還是后者都存在著不足，過柱的速度通常較慢，且質(zhì)粒DNA的電荷性和疏水性與雜質(zhì)RNA、內(nèi)毒素、宿主蛋白都很相似，不易掌握具體的pH和鹽濃度；醇類的濃縮需要的體積很大，無疑增加了成本，而且有背于不能使用易燃、易爆物品的原則。因此，其他的濃縮方法應(yīng)運而生，這包括分子切向流法80,小分子類物質(zhì)如精胺79、十六烷基三甲基溴化銨80、聚電解質(zhì)81等，另外芳香化合物82和MnCL283等都有報道。4.4 宿主細胞中核酸和其他內(nèi)容物的組成正常生理狀況下，大腸桿菌宿主細胞含有水、核酸、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素和小分子和一些離子，其占有含量和種類各不相同，分子量也差異很大，如Atkinson84所述，見表。種類總量（W/W）種類/個細胞平均分子量水70118核酸基因組0.51a2.8106轉(zhuǎn)移RNA4.84028核糖體RNA0.93500-1000信使RNA0.3400-800660-990質(zhì)粒DNA113300b蛋白質(zhì)1511008-200內(nèi)毒素510小分子和離子3800-2001a快速生長的大腸桿菌細胞中含有4個基因組分子。b質(zhì)粒分子大小為5kb。4.4.1 RNA粗制的質(zhì)粒DNA中，RNA的含量是質(zhì)粒DNA含量的20倍左右78，因此，如何有效地消除RNA尤其是大分子量的核糖RNA和信使RNA十分重要?，F(xiàn)今，絕大多數(shù)的純化方法都使用了牛源性的RNase A，這有違于禁止使用動物源性酶制劑的相關(guān)條例85。2001年，Cooke86有使用表達RNase A基因的宿主菌來制備質(zhì)粒DNA的成功報道，本實驗室也有使用大腸桿菌分泌表達的重組牛RNase A來消除RNase A的成功經(jīng)驗（未發(fā)表）。David87 的試驗結(jié)果表明在堿性條件下長時間孵育也可以很好地消除RNA，但是根據(jù)我們的試驗數(shù)據(jù)，超螺旋質(zhì)粒DNA的比列嚴重下降，損害了質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。此外，37利用內(nèi)源性RNase A也可去除40的RNA88，2M的氯化鈣89、5M氯化鋰5等都可成功消除RNA。4.4.2 蛋白質(zhì)粗制質(zhì)粒中雜蛋白的含量也相當(dāng)可觀，一定數(shù)量的雜蛋白除了降低質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率外，可引起機體的異源免疫反應(yīng)，它的去除一直依賴于對人體和環(huán)境有污染和腐蝕的苯酚、氯仿?？紤]到蛋白的分子量遠遠比質(zhì)粒DNA小，Teeters認為可以利用分子量上的巨大差異來去除蛋白質(zhì)92。Russel J 80和 Wahlund81報道利用CTAB或聚電解質(zhì)與DNA雙螺旋大小溝特異結(jié)合的特性可以選擇性沉淀DNA，而將雜蛋白留在上清中，通過離心就達到去除蛋白的目的。另外，用離子交換層析91和親和層析柱92等技術(shù)都可以除去蛋白質(zhì)，達到純化質(zhì)粒DNA的目的，并取得了很好的純化效果。4.4.3 內(nèi)毒素細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外膜上的特有結(jié)構(gòu)，在細菌生長、死亡的過程中被釋放出來，在質(zhì)粒制備過程當(dāng)中，細胞破碎后，大量的內(nèi)毒素都釋放到溶液中93。由于內(nèi)毒素具有極強的熱源性，少量的LPS就可以引起發(fā)燒、血液循環(huán)障礙甚至休克死亡，因此它的去除顯得十分地重要94。由于內(nèi)毒素常常形成囊狀結(jié)構(gòu)，其分子量與質(zhì)粒大小相似，而且電荷性與疏水性都與質(zhì)粒DNA相似，給質(zhì)粒DNA的純化帶來了很大的麻煩。目前，內(nèi)毒素的去除方法主要分為三大類：一是非選擇性去除，包括活性炭吸附和萃取95，利用分子量差異進行的超濾96和pH值差異進行的離子交換色譜97，這幾種方法沒有考慮到LPS結(jié)構(gòu)方面的特殊性質(zhì)，去除效率較低；二是選擇性去除，主要是指親和色譜法，找出適當(dāng)?shù)呐浠?，將其固載于親和色譜的基質(zhì)上合成出親和介質(zhì)，即可成為一種高效能、高選擇性的LPS吸附劑，這些包括組胺、組胺酸類98；多粘菌素B99；聚陽離子配基如PEI100，聚-L-賴氨酸101；荷正電聚合物-甲基-L-谷氨酸酯102等；三是特異性去除法，這是根據(jù)LPS結(jié)合蛋白（LBP）的結(jié)構(gòu)和功能，提出的一種內(nèi)毒素去除的特異性配體。4.4.4 基因組DNA符合藥物動力學(xué)質(zhì)粒中的宿主基因組DNA的含量必須小于10ng/g質(zhì)粒DNA，在發(fā)酵至純化的過程中，由于酶解和機械剪切力的作用，宿主基因組非常易斷，而現(xiàn)行的離子交換等各層析法純化質(zhì)粒DNA包括了其不能有效去除宿主基因組DNA和內(nèi)毒素的缺點，在消除基因組DNA的試驗中，以Levy103 和 Winters104的硝酸纖維膜和硅酸鈣最為有效。4.5 質(zhì)粒純化策略氯化銫密度梯度超速離心是質(zhì)粒純化的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，但此方法耗時，而且難以擴大，并使用了有毒和誘變試劑，不適合用于臨床的質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)。雖然目前純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)還很不成熟，但一些方法具有很大的吸引力。從目的上來講，實驗室制備小量的質(zhì)?？赡芨嗟膹募兌壬峡紤]，但是要大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒，除了純度上的問題，還有過程的可放大性，重現(xiàn)性，成本等諸多問題需解決。4.5.1 離子交換色譜離子交換色譜（Ion exchange chromatography, IEC）利用離子交換劑為固定相，是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進行溶質(zhì)分離的洗脫層析法。鑒于核酸溶液帶有多聚陰離子，可以采用陰離子交換色譜的方法純化質(zhì)粒 DNA105。DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)使親水性和疏水性基團分離，疏水性堿基處于雙螺旋的內(nèi)部，兩條螺旋形糖-磷酸鏈纏繞在雙螺旋結(jié)構(gòu)的外側(cè)，從而形成多陰離子、高度水化的親水表面，Stahlberg 等人106提出一種量化理論，假定帶有多電荷的生物分子和離子交換劑表面間的相互作用，可以看作是兩個帶電荷表面在與緩沖鹽溶液接觸時的遠距離靜電作用，固定相表面是帶電荷的基團，使其表面和溶液之間產(chǎn)生了靜電勢差，從而具有吸引那些帶有相反電荷的溶質(zhì)分子來到表面的能力。4.5.2 分子排阻色譜分子排阻色譜，又被稱為凝膠過濾，可以用來分離不同大小及具有不同流體力學(xué)半徑的分子。與陰離子交換樹脂不同，用作分子排阻色譜的樹脂不和質(zhì)粒或者其它雜質(zhì)結(jié)合，該樹脂包含有具有確定大小的通道。較小的分子比較大的分子更容易進入這些孔中，并且由此在柱中的流動受到阻礙。既然不用以高濃度的鹽或者有機試劑來洗脫質(zhì)粒，分子排阻色譜的操作顯得相對較為簡單。洗脫順序與分子大小順序相反，最大的分子最先洗出。分子排阻色譜在將質(zhì)粒DNA從小的RNA片段及被RNA 酶消化的核酸中分離出來顯得特別有效，它也能被用于移除質(zhì)粒溶液中的鹽、緩沖液和其它低分子量的化學(xué)試劑。分子排阻色譜也可能將質(zhì)粒從比它更大的 gDNA 分子中分離出來，而且，分子排阻色譜在移除內(nèi)毒素方面顯得很有成效。但分子排阻色譜有相對較低的分辨率，一般要將兩種分子達到完全的分離需要這兩種分子大小相差至少兩倍。因此，在分子大小上與質(zhì)粒 DNA 相近的染色體 DNA 以及高分子量的 RNA 片段就很難由分子排阻色譜除掉。該基質(zhì)的排阻極限對蛋白質(zhì)是 100106 Da，對線性DNA是20kb，對球狀微粒是 400nm。70的回收率中洗下部分幾乎是純的超螺旋質(zhì)粒 DNA107。4.5.3 疏水色譜大腸桿菌gDNA本身是雙鏈DNA，但經(jīng)堿裂解之后，絕大多數(shù)變成了單鏈，兩條鏈相互分離并部分斷裂，因此疏水堿基暴露，在疏水色譜（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）過程中，質(zhì)粒分子的疏水堿基隱藏在雙螺旋內(nèi)部，與配基的作用力非常微弱，另一方面，高濃度的單鏈核酸，如RNA和變性的gDNA則與配基牢固結(jié)合，同樣道理，變性的質(zhì)粒DNA也暴露了疏水堿基，可以通過HIC去除，LPS通過脂基團而與HIC的配體發(fā)生作用，而且只有在降低鹽離子濃度后方可被洗脫，合成的寡核苷酸進行的試驗表明，單鏈越長，與HIC柱子吸附的時間越長，說明了核酸分子中堿基多少與吸附時間成正相關(guān)。Diogo108報道通過此方法可以降低內(nèi)毒素的含量20倍以上，天津大學(xué)的Yuan Li109等人報道使用HIC來純化質(zhì)粒pcDNA3.0也獲得了良好的效果。4.5.4 親和色譜親和層析基于連接在固相支持物上的寡聚核苷和引入目標(biāo)質(zhì)粒的特定序列之間形成的三重螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)展起來110。顯然，這些支持物對超螺旋構(gòu)型的質(zhì)粒的親和力比對松弛異構(gòu)體的親和力高。回收率可高達62，同時將RNA和gDNA 的含量降低到檢測不出的水平。另外，乳糖阻遏蛋白等也能與特殊DNA序列結(jié)合的物質(zhì)小規(guī)模純化質(zhì)粒。不管是寡聚核苷和質(zhì)粒結(jié)合還是特殊的蛋白和質(zhì)粒結(jié)合，親和配體和固定相偶聯(lián)，并同質(zhì)粒的目標(biāo)序列相互作用。因為這種結(jié)合是依據(jù)特定序列的，所以親和色譜能夠高效地將質(zhì)粒DNA從蛋白質(zhì)，RNA 和非特定DNA中分離出來。然而，這些方法也只限于小規(guī)模的質(zhì)粒純化。這主要是因為構(gòu)建大量的親和樹脂在技術(shù)上有困難，同時成本很大。此外， Woodgate111 和 Kostal112 分別研究了使用鋅指結(jié)構(gòu)的GST的序列特異性的層析和以溫度誘導(dǎo)金屬調(diào)節(jié)蛋白MerR進行質(zhì)粒純化的策略，這兩項研究可以叢細胞裂解液中直接純化質(zhì)粒DNA，規(guī)?？梢苑糯螅禺愋院?，成本也較低，為今后的質(zhì)粒純化提供了一定的借鑒。4.5.5 芳香層析2003和2004年，Lemmens和Lena M82，113先后報道了在高濃度離液劑或水化鹽的情況下，使用芳香硫醚為配基的親硫?qū)游鲞M行了高質(zhì)量的質(zhì)粒純化，其機制可能是包括質(zhì)粒DNA在內(nèi)的各種核酸分子在高濃度水化鹽如硫酸銨的存在下，各分子發(fā)生不同程度的濃縮和結(jié)構(gòu)的改變，而恰恰是這種結(jié)構(gòu)的改變促使超螺旋質(zhì)粒DNA可以通過-作用與配基上的芳香基團結(jié)合而被純化。4.5.6 去污劑CTAB 是一種陽離子表面活性劑，它可以與DNA 分子上帶有負電荷的磷酸基團發(fā)生強烈的靜電相互作用，同時，其碳鏈也可以和 DNA 分子發(fā)生疏水互作用，從而中和帶電的 DNA 分子使它們從溶液中沉淀下來。向細胞裂解液緩慢地加入CTAB，一方面，可以選擇性地沉淀質(zhì)粒DNA；另一方面，蛋白質(zhì)、RNA和脂多糖等雜質(zhì)保持完全溶解的狀態(tài)。質(zhì)粒沉淀后，可以往沉淀中加入濃的氯化鈉溶液來去除 CTAB。質(zhì)粒沉淀物中還含有少量 gDNA，但是如果加入的氯化鈉的量控制得很精確，就可以只溶解質(zhì)粒 DNA，而 gDNA 仍然保持沉淀狀態(tài)。在使用 CTAB 沉淀純化質(zhì)粒 DNA 后，質(zhì)粒的純度達到 90，再用鹽溶液溶解之后，質(zhì)粒純度達到 9980。使用這種方法大規(guī)模純化質(zhì)粒的關(guān)鍵在于 CTAB 及 NaCl 的加入應(yīng)該做到精確控制。因此，在線實時檢測系統(tǒng)顯得必不可少。2005年，*學(xué)者Chowdhury報道使用兩性去污劑十二烷基二甲酯氨硫璜丙烷和堿來純化高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA114，其作用原理可能是去污劑使蛋白分子等雜質(zhì)隨機組裝從而形成可見的“軟”沉淀，而質(zhì)粒DNA則通過靜電作用被包裹并與雜質(zhì)形成分離，并由于兩性去污劑獨特的作用溶解在可溶相中。4.5.7 濃縮沉淀劑常規(guī)的質(zhì)粒DNA純化方法耗時長、使用了吸附劑、核酶和過濾介質(zhì)等，限制了質(zhì)粒DNA的規(guī)模化提取。1999年，Jamie115報道了使用濃縮沉淀劑來選擇沉淀質(zhì)粒DNA的原理，該類沉淀劑是小的陽離子分子，可以與雙鏈DNA的大溝和小溝相結(jié)合，縮小DNA體積4-6倍，同時還起到包裹DNA的作用，在其濃縮沉淀質(zhì)粒DNA的過程中，一般都在低的鹽離子下進行。當(dāng)其與大、小溝上的磷酸基團相互作用，周圍的DNA分子都發(fā)生濃縮時即可發(fā)生沉淀，而且，這些分子不但減少了雙螺旋之間的排斥作用，還使其相互連接。這種應(yīng)用最早是Hoopes和McClure116在用精胺和亞精胺從小分子中沉淀大分子DNA的試驗中被證實，最初鮭精DNA，Pbgs19Luxwt（6.0kb）均在低離子濃度下被沉淀，而在600mM的NaCl中未出現(xiàn)沉淀。Mourich79于2004年也有用精胺純化pTH.HM的報道，并比較了其與QIAGEN公司無內(nèi)毒素試劑盒純化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，成本為3.16美元/毫克質(zhì)粒。Bloomfield和Shenoy報道的MnCl283與精胺一樣，同樣可以通過與DNA大小溝結(jié)合來分離和純化質(zhì)粒DNA。4.5.8 磁性分離法2005年，中國臺灣的Chen-Li Chiang117-118連續(xù)報道了使用化學(xué)方法制備微小顆粒Fe3O4，并用多聚陽離子聚乙烯亞胺（PEI）包裹，將其置于磁場下，通過順磁性可以從細菌裂解液中直接純化質(zhì)粒DNA，這種磁性顆粒在磁場下，具有磁性強和低毒性的特點，在生物領(lǐng)域備受關(guān)注，嚴格來講，只有在磁場中，它們才呈現(xiàn)磁性，而且這個特性使得其可重新分散和重復(fù)利用。金屬可以鰲合氨基酸從而來純化蛋白，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，金屬同樣可以鰲合暴露出的嘌呤堿基而與單鏈核酸結(jié)合而與質(zhì)粒DNA分離，Balan119等研究證實，用銅載的多聚N異丙基聚丙酰烯胺和乙烯基咪唑，可以從宿主菌裂解液中特異吸附RNA分子，從而達到純化質(zhì)粒DNA的目的，先前質(zhì)粒DNA的純化大都依靠吸附、密度或結(jié)構(gòu)差異從基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)中分離質(zhì)粒，用金屬來分離純化核酸的報道非常少見，鰲合配基如次氮基三乙酸和亞胺酸與二價金屬離子偶聯(lián)，通過-d的軌道重疊，與芳香氮具有高親和力，從而達到純化效果。4.5.9 雙水相分離質(zhì)粒DNA1962年，Albertson120是最早利用雙相分離法生物分子的研究工作者之一，但是該技術(shù)在質(zhì)粒DNA純化上的進展緩慢，1978和1991年才由Ohlsson121和Cole122報道了兩個研究報道。直至2002年，Ribeiro123系統(tǒng)描述了用PEG/磷酸鹽的兩相法純化質(zhì)粒DNA的報道，并證明用PEG600和PEG1000與磷酸鹽組成的兩相分離體系的回收率高，雜質(zhì)少，具有喜人的前景，隨后兩年，Trindade124 和Kepka125也分別有用兩相分離法純化質(zhì)粒DNA的報道。4.5.10 分子切向流Tangential flow filtration(TFF)技術(shù)主要利用質(zhì)粒DNA、RNA、基因組DNA等分子的大小不同，濾掉RNA和蛋白質(zhì)等小分子，而將質(zhì)粒DNA保留在膜上，使用TFF的主要注意事項是跨膜壓、膜孔和緩沖液的傳導(dǎo)性。Eon-Duval78使用TFF技術(shù)成功地純化了含有乙肝表面抗原基因的質(zhì)粒（7.7kb），David使用TFF技術(shù)純化了6種質(zhì)粒DNA，RNA的去除率達99以上，蛋白質(zhì)的消除也大于95。除了以上列舉的方法之外，還有許多改進的純化策略，如使用膜126(membrane)和盤127（monolith）制作的色譜技術(shù)，一改以往柱吸附效率低下，不適合規(guī)模化生產(chǎn)的缺點。五、質(zhì)量控制及檢定的要求基于質(zhì)粒 DNA 的生物藥劑是高度化學(xué)限定的，因此能用化學(xué)，生化和物理試劑對其進行分析。為確保產(chǎn)品符合規(guī)格而分析所制備的質(zhì)粒的安全性、效力及純度是使整個生產(chǎn)流程得以建立的關(guān)鍵問題。評價用作基因治療和 DNA 疫苗的 DNA 產(chǎn)品的純度，安全性及效力的主要標(biāo)準(zhǔn)和推薦試劑如下所示：5.1 產(chǎn)過程中質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)的建立及要求在生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟中對其產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝的進行。由于各種方法的工藝不同，所制定的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)和在何步驟進行監(jiān)控可能不同，但其原則是保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的連續(xù)性和穩(wěn)定性。5.2 產(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求外觀檢查：根據(jù)樣品的特征建立外觀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，高純度的質(zhì)粒DNA呈現(xiàn)生魚肉透明狀，pH一般為7205。純度：主要是評價純化的重組DNA制品中是否含有宿主RNA、DNA、內(nèi)毒素和蛋白的污染。一般采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測制品中有無RNA，要求無明顯的RNA帶型；采用Northernblot或熒光定量PCR的方法檢測制品中殘留的宿主DNA的含量，在該方法的研究時應(yīng)建立宿主DNA的標(biāo)準(zhǔn)品，并對該類試劑的敏感性和特異性進行驗證。要求DNA制品中殘余的宿主DNA含量不超過0.01g/g 質(zhì)粒?？梢远量蓪幩岱z測制品中宿主蛋白的殘余量，在該方法的研究過程中應(yīng)建立宿主蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)，并對檢測方法的敏感性和特異性進行驗證，其性能能滿足該實驗的要求，宿主蛋白的含量應(yīng)不超過0.001g/g質(zhì)粒DNA。可以檢測樣品在波長為260nm和280nm的紫外吸收值，并計算A260/A280的比值，評價制品的總體純度，要求其比值在1.75-1.85之間。質(zhì)粒大小的均一性和結(jié)構(gòu)的分析：主要是分析超螺旋結(jié)構(gòu)與線性和松弛性質(zhì)粒的比例，一般采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對制品進行電泳分析，并用掃描儀對電泳結(jié)果進行掃描，分析各帶型所占的比例，一般要求環(huán)狀結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒所占的比例在90%以上。鑒別實驗：主要是對重組質(zhì)粒的特征以及是否含有正確的插入片段進行分析。至少用三對以上限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行酶切，對酶切產(chǎn)物分別進行電泳分析，觀察是否有特征性的帶型；用PCR方法對插入片段進行擴增或用特征性的酶切方法分析插入的基因片段的大小是否與預(yù)計的大小一致。體外效力實驗：體外轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，檢測其表達量，需建立定量檢測表達抗原的方法以及表達抗原的定量標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)檢測表達抗原的圖譜，其各表達目的抗原的大小應(yīng)與預(yù)計大小相同，應(yīng)建立相應(yīng)的方法并進行驗證。制定各表達抗原的量和圖譜的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。無菌實驗：應(yīng)檢測需氧菌、厭氧菌以及支原體等，制品中應(yīng)無該類微生物的污染。熱原實驗：主要檢測制品中有無熱原物質(zhì)，可用鱟試劑檢測細菌的內(nèi)毒素，要求內(nèi)毒素的含量不高于01EU/ug；也可以用其它方法如家兔試驗檢測制品的熱源。抗生素及其它添加物質(zhì)殘余量的檢測，由于DNA載體一般使用抗菌素的選擇性標(biāo)記，重組DNA的研制和制備過程中采用含抗菌素的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在純化制品中對抗菌素的含量應(yīng)進行限制，因此，應(yīng)建立檢測抗菌素的檢測方法并制定抗生素殘留量的要求。在重組DNA的培養(yǎng)和純化工藝中，可能需要一些其它物質(zhì)或基質(zhì)，如純化工藝中可能需要乙醇，這些物質(zhì)可能對人體有潛在的危害，應(yīng)在純化制品中限制其含量，因此，應(yīng)建立檢測方法并制定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)。安全性實驗：該實驗是控制該類制品質(zhì)量的重要指標(biāo)，由于該制品與一般生物制品相比又有其特殊性，因此，在安全性方面除了考慮一般的安全性實驗，還應(yīng)考慮該制品的特異性安全性。穩(wěn)定性實驗：由于DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，而且超螺旋結(jié)構(gòu)的比例多少可能影響重組DNA的轉(zhuǎn)染率，因此，在該類制品的穩(wěn)定性實驗中應(yīng)主要考慮超螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。應(yīng)建立檢測超螺旋質(zhì)粒穩(wěn)定性實驗方法，并建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。生物效價：由于用于預(yù)防的DNA制劑所發(fā)生作用的原理不同，評價其生物效價的方法也不同。如果DNA制劑是通過免疫反應(yīng)發(fā)生作用的，則應(yīng)評價其體液免疫和細胞免疫的生物效價。在評價體液免疫效價時，應(yīng)選擇實驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的診斷試劑，并對該類試劑進行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當(dāng)建立評價抗體質(zhì)量的方法，對抗體的質(zhì)進行評價；在評價細胞免疫效價時，應(yīng)當(dāng)建立檢測評價細胞免疫的方法（如特異性CTL反應(yīng)的方法或Elispot方法等），也可通過對細胞因子的定量檢測評價其細胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項目，該類方法應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。若有動物模型，可進行動物保護性實驗。佐劑或呈遞物質(zhì)的質(zhì)量評價：如在最終重組DNA制品含有佐劑或呈遞物質(zhì)，則應(yīng)建立檢測該類物質(zhì)的量以及與重組DNA結(jié)合率的方法，并制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。六、質(zhì)粒DNA的應(yīng)用伴隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，DNA疫苗及基因治療的優(yōu)勢已被在多個領(lǐng)域證實，而DNA疫苗和基因治療最終必需是依賴質(zhì)粒的形式來發(fā)揮作用。6.1 DNA疫苗DNA疫苗是上世紀九十年代發(fā)展起來的新技術(shù)，即將外源基因克隆到真核表達載體上構(gòu)建DNA疫苗質(zhì)粒，DNA疫苗經(jīng)過各種途徑注射到動物基體內(nèi)后，可被宿主細胞吸收和攝取，進入宿主細胞的細胞核中轉(zhuǎn)錄成mRNA，再在胞漿中翻譯成蛋白質(zhì)。其中一部分蛋白質(zhì)在降解后與MHC類分子結(jié)合，并被遞呈到細胞表面被CD8 T細胞的受體識別，而激活細胞毒T細胞的活性；另一部分蛋白質(zhì)也可以分泌出去，再像外源蛋白一樣被抗原提呈細胞攝取，在吞噬溶酶體內(nèi)降解成多肽，并進一步與MHC類分子結(jié)合，有抗原提呈細胞提呈到細胞表面被Th2細胞的受體識別，然后由Th2細胞分泌的細胞因子作用于B細胞，而刺激以抗體產(chǎn)生為主的體液免疫4。DNA疫苗不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫，而且可誘導(dǎo)強烈而持久的細胞免疫，還可避免向外界排毒，而且DNA疫苗與減毒和弱毒疫苗不一樣，其不存在毒力反強等問題。其安全性及高效性是傳統(tǒng)疫苗所達不到的，所以，該技術(shù)在病毒、細胞內(nèi)寄生所引起的傳染病、寄生蟲以及腫瘤防治中顯示出巨大的潛力。Wolff128首先對重組質(zhì)粒可以在小鼠體內(nèi)表達進行了報道，外源蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達長達60天，提示質(zhì)粒DNA可以在體內(nèi)相當(dāng)一段時間內(nèi)進行表達，可以用作治療性作用，并頓時引起了廣泛的研究。6.2 基因治療基因治療對于癌癥、動脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎、阿耳茨海默氏病等因為特定基因活動異常而引起的疾病的預(yù)防和治療很有前景8。該療法是一種將核酸引入人細胞以用來修改它們的遺傳特性而達到治療目的的治療策略。通常，該核酸是能夠編碼起治療作用，破壞作用或者標(biāo)記作用的蛋白質(zhì)的雙鏈 DNA分子(dsDNA)。該核酸也可能是與宿主細胞里的目標(biāo)序列結(jié)合，通過阻止 mRNAs或者啟動子來抑制特定基因表達的反義 RNA 或者單鏈 DNA(ssDNA)。至今，以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的基因治療、癌癥疫苗等已經(jīng)超過了600例，質(zhì)粒DNA的基因免疫模擬了病原體在細胞內(nèi)的基因表達途徑，已經(jīng)成功地應(yīng)用來治療下肢的局部缺血，心血管再生，并極有希望通過核酸疫苗來預(yù)防現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疑難雜癥，包括瘧疾、艾滋病、乙肝和結(jié)核病等。對于基因治療，質(zhì)粒不能整合入基因組DNA也許是個缺點，但是質(zhì)?？梢愿郊芋w的形式存在于細胞核中，也可以持續(xù)表達相當(dāng)長的一