高中生物 第4章 現(xiàn)代生物技術(shù) 第15課時(shí) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)同步備課課件 北師大版選修1.ppt

第15課時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) 第4章現(xiàn)代生物技術(shù) 學(xué)習(xí)導(dǎo)航1 閱讀教材p77 78內(nèi)容 掌握pcr技術(shù)原理 2 結(jié)合教材p79 80內(nèi)容 了解pcr技術(shù)的基本操作過程 討論pcr技術(shù)的影響因素 重難點(diǎn)擊1 簡述pcr的原理 2 了解pcr技術(shù)的基本操作過程并討論pcr技術(shù)的影響因素 一 pcr的原理 二 dna片段的pcr擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測 內(nèi)容索引 當(dāng)堂檢測 一 pcr的原理 基礎(chǔ)梳理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡稱pcr 是一種體外迅速擴(kuò)增dna片段的技術(shù) 這項(xiàng)技術(shù)中dna復(fù)制的過程和細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制的過程是類似的 請結(jié)合已學(xué)習(xí)的dna分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制的相關(guān)知識 分析pcr的原理 1 dna的平面結(jié)構(gòu)示意圖 1 寫出各個(gè)標(biāo)號的名稱 胞嘧啶 腺嘌呤 鳥嘌呤核糖 胸腺嘧啶 脫氧核糖 磷酸基團(tuán) 胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸 氫鍵 堿基對 一條脫氧核糖核苷酸鏈 2 dna的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?為了明確表示dna鏈的方向 通常將羥基末端稱為3 端 將磷酸基團(tuán)的末端稱為5 端 按此原則在圖上方框內(nèi)標(biāo)出兩條鏈的方向 答案左鏈上5 端 下3 端 右鏈上3 端 下5 端 2 細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制條件分析 脫氧核糖核苷酸 兩 dna雙螺旋 合成dna子鏈 atp 3 端 3 pcr原理與反應(yīng)過程 1 pcr概念 是一種的技術(shù) 它能以極少量的dna為模板 在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的dna拷貝 體外酶促合成特定dna片段 2 條件及作用 合成dna時(shí)所需要的特異引物 原料 耐熱t(yī)aqdna聚合酶 緩沖溶液 3 反應(yīng)過程 變性 溫度上升到 時(shí) 目的dna雙鏈為單鏈模板 復(fù)性 溫度下降到 左右 兩種引物通過與兩條單鏈dna結(jié)合 94 98 變性解旋 40 60 堿基互補(bǔ)配對 延伸 溫度上升到 左右 溶液中的在耐熱的 的作用下 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的dna鏈 循環(huán) 繼續(xù)上述的3個(gè)過程 dna片段被不斷的擴(kuò)增 若開始加入了n個(gè)dna模板片段 理論上 循環(huán)n次后能獲得個(gè)dna片段 72 四種脫氧核糖核苷酸 taqdna n 2n 聚合酶 1 pcr原理pcr反應(yīng)與體內(nèi)dna復(fù)制的引物在化學(xué)本質(zhì)上是否相同 請分析原因 答案不相同 體內(nèi)dna復(fù)制所需引物為rna聚合酶合成的一小段rna 但pcr反應(yīng)時(shí)所用引物一般是人工合成的單鏈dna片段 問題探究 答案 答案 2 pcr反應(yīng)過程 1 pcr反應(yīng)中需要解旋酶和dna聚合酶嗎 若需要 則與細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制有何區(qū)別 答案pcr反應(yīng)不需要解旋酶 但需要dna聚合酶 由于pcr反應(yīng)中需要高溫使dna解旋 因此pcr所需的dna聚合酶需耐高溫 2 pcr的每次循環(huán)中應(yīng)如何控制溫度 請分析原因 答案每次循環(huán)中先高溫解旋 再低溫使引物與模板結(jié)合 最后適當(dāng)升溫有利于taqdna聚合酶發(fā)揮作用 3 結(jié)合下圖分析pcr過程中dna復(fù)制的方向是怎樣的 答案dna的羥基 oh 末端為3 端 磷酸基團(tuán)的末端為5 端 當(dāng)引物與dna母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后 dna聚合酶就能從引物的3 端開始延伸dna鏈 dna的合成方向總是從子鏈的5 端向3 端延伸 答案 pcr擴(kuò)增與dna復(fù)制的異同 歸納總結(jié) 拓展應(yīng)用 1 下列關(guān)于dna復(fù)制和pcr技術(shù)的描述中 正確的是a dna聚合酶不能從頭開始合成dna 只能從5 端延伸dna鏈b dna復(fù)制不需要引物c 引物與dna母鏈通過堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行結(jié)合d pcr擴(kuò)增的對象是氨基酸序列解析dna聚合酶不能從頭開始合成dna 故dna復(fù)制需要引物 dna聚合酶只能從3 端延伸dna鏈 而不能從5 端延伸dna鏈 引物通過堿基互補(bǔ)配對原則與dna母鏈相結(jié)合 pcr擴(kuò)增的對象是dna 不是氨基酸序列 答案 解析 2 pcr技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分衐na含量太低難以對樣品進(jìn)行研究的問題 而被廣泛應(yīng)用 與細(xì)胞內(nèi)的dna復(fù)制相比 pcr可以快速擴(kuò)增所需的dna片段 請分析回答下列有關(guān)問題 1 體內(nèi)dna復(fù)制過程中用解旋酶打開雙鏈dna 而pcr技術(shù)中的解旋原理是 解析pcr技術(shù)中用高溫使dna分子中的氫鍵打開 從而解旋 其原理是dna的熱變性原理 答案 解析 dna的熱變性原理 2 此過程需要一種taqdna聚合酶 該酶是從中分離的 解析taqdna聚合酶是從水生耐熱細(xì)菌taq中提取的 3 與普通dna聚合酶相比 taqdna聚合酶具有的特性是 解析與普通dna聚合酶相比 taqdna聚合酶在90 以上的環(huán)境中不變性 具有耐高溫的特性 4 與體內(nèi)dna復(fù)制相比較 pcr反應(yīng)要在中才能進(jìn)行 并且要嚴(yán)格控制條件 解析pcr反應(yīng)需要適宜的溫度和ph 因此pcr反應(yīng)要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行 并需嚴(yán)格控制好溫度條件 答案 解析 水生耐熱細(xì)菌taq 耐高溫 一定的緩沖溶液 溫度 5 pcr中加入的引物有種 加入引物的作用是 解析pcr需要兩種引物 引物的識別位點(diǎn)決定了pcr擴(kuò)增的dna片段 pcr中加入的引物一般是一小段單鏈dna 作用是引導(dǎo)dna復(fù)制 可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵 成為dna復(fù)制的起點(diǎn) 答案 解析 2 作為dna復(fù)制的起點(diǎn) 細(xì)胞內(nèi)的dna復(fù)制需要適宜的溫度和ph嗎 若需要 是如何實(shí)現(xiàn)的 答案需要 細(xì)胞內(nèi)的適宜溫度和ph與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關(guān) 低等生物與環(huán)境因素有關(guān) 答案 與pcr原理有關(guān)的三個(gè)易錯(cuò)點(diǎn) 1 酶的作用位點(diǎn) 解旋酶的作用是使dna兩條鏈之間的氫鍵斷開 dna聚合酶與dna連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵 不要誤認(rèn)為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵 2 dna聚合酶和dna連接酶 dna聚合酶是將單個(gè)核苷酸連接到已有的單鏈片段的3 端上 需要模板 而dna連接酶連接的是兩條dna片段的缺口 不需要模板 3 pcr中的解旋過程 pcr過程中不需要解旋酶 需要升高溫度才能打開氫鍵 但此時(shí)的溫度不會破壞磷酸二酯鍵 因此 dna加熱變性后變?yōu)閱捂?并未分解成單體 二 dna片段的pcr擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測 基礎(chǔ)梳理 dna片段的pcr擴(kuò)增可以利用pcr熱循環(huán)儀完成 而產(chǎn)物的檢測則利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 閱讀教材 完善下列內(nèi)容 1 dna片段的pcr擴(kuò)增 按照pcr反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放于實(shí)驗(yàn)桌上 用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組成成分 蓋嚴(yán)離心管口的蓋子 用手指輕輕彈擊管壁 準(zhǔn)備 移液 混合 將微量離心管放在離心機(jī)上 離心約10s 目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部 將離心管放入pcr儀中 設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng) 1 加入離心管中的物質(zhì)應(yīng)包括 酶 4種 2種 緩沖液 2 離心管中要加入少量石蠟油 目的是 離心 反應(yīng) 模板dna taqdna聚合 三磷 酸脫氧核苷酸 引物 防止反應(yīng)溶液的揮發(fā) 3 熱循環(huán)儀的反應(yīng)程序應(yīng)設(shè)定為 94 94 40 72 4 影響因素 在pcr實(shí)驗(yàn)中 需要擴(kuò)增的dna片段的大小決定延伸的時(shí)間 片段越大 中溫延伸的時(shí)間 引物的堿基數(shù)量和組成則決定著復(fù)性溫度的選擇 如果引物越短 a t含量越多 復(fù)性溫度就 反之引物越長 g c含量越多 復(fù)性溫度就 這是因?yàn)間 c之間是由 個(gè)氫鍵連接 a t之間是由個(gè)氫鍵連接 5 pcr過程中 循環(huán)次數(shù)是不是越多越好 答案不是 taqdna聚合酶在pcr擴(kuò)增過程中存在1 10 5的出錯(cuò)幾率 而且隨著循環(huán)次數(shù)的增加 其活性也會逐漸降低 因此 pcr過程中 循環(huán)次數(shù)并非越多越好 一般控制在25 35個(gè)循環(huán) 越長 越低 越高 3 2 2 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 1 原理 瓊脂糖凝膠具有大小一致的剛性濾孔 帶有大量負(fù)電荷的dna分子在外加電場的作用下可以通過這些濾孔向正極泳動 dna片段在凝膠中的泳動速率主要取決于其分子的大小 因此大小一致的dna分子會在凝膠的一定位置形成dna條帶 2 過程配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 的瓊脂糖凝膠 制作成電泳膠板 在dna樣品中加入0 2倍體積的混勻 載樣緩沖液 取20 l加入內(nèi) v穩(wěn)壓電泳20 40min 當(dāng)指示劑電泳到凝膠底部時(shí) 切斷電源 將膠板浸入溶液染色5 10min 在上觀察電泳條帶 樣品孔 80 溴酚藍(lán) 溴化乙錠 紫外透射儀 問題探究 答案 1 實(shí)驗(yàn)過程分析 1 離心的目的是什么 在離心的過程中 微量離心管的蓋子為什么一定要蓋嚴(yán) 答案離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部 提高反應(yīng)效率 微量離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán) 防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢 2 在離心前要用手輕輕彈擊管的側(cè)壁 目的是什么 答案離心前用手輕輕彈擊管的側(cè)壁目的是使反應(yīng)液混合均勻 3 pcr實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管 槍頭 緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌 為什么這樣操作 還有哪些操作與此目的相同 答案為避免外源dna等的污染 在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí) 每吸取一種試劑后 移液器上的槍頭都必須更換 2 結(jié)果檢測 1 實(shí)驗(yàn)中為什么要測定dna的含量 答案實(shí)際操作過程中會有許多因素影響dna含量 所以需要對dna含量進(jìn)行測定 答案 2 如何判斷dna擴(kuò)增成功 答案 可以通過計(jì)算dna含量來評價(jià)擴(kuò)增的效果 電泳檢測的方法 可以通過在紫外線下直接觀察dna帶的分布及粗細(xì)程度來評價(jià)擴(kuò)增的效果 3 pcr擴(kuò)增過程可能會出現(xiàn)哪些異常結(jié)果 答案樣品產(chǎn)物少 或產(chǎn)生新的dna 答案 歸納總結(jié) pcr擴(kuò)增dna片段的操作要點(diǎn) 1 避免外源dna的干擾 所用儀器 緩沖液 蒸餾水等都需要在使用前高壓滅菌 2 緩沖液 酶 dna引物和dna模板等如果長期保存 需要在 20 冰箱內(nèi)保存 其中 dna引物和dna模板要避免反復(fù)凍融 否則容易造成dna的降解 3 在用微量移液管混合pcr反應(yīng)體系的各種成分時(shí) 一定注意避免各種溶液之間的相互污染 需遵循每吸取一種溶液就要更換一個(gè)槍頭的原則 4 為防止dna引物與模板dna在室溫非特異性結(jié)合進(jìn)行pcr反應(yīng) 需在冰盒上混合pcr擴(kuò)增體系的各種組分 5 為避免反應(yīng)過程中高溫使ep管中的水蒸氣溢出管外而導(dǎo)致pcr過程中各種成分的濃度發(fā)生變化 須在pcr反應(yīng)過程中加入無菌的石蠟油防止溶液的揮發(fā) 拓展應(yīng)用 3 使用pcr儀具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為 設(shè)計(jì)好pcr儀的循環(huán)程序 按配方準(zhǔn)備好各組分 用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分 進(jìn)行pcr反應(yīng) 離心使反應(yīng)液集中在離心管底部a b c d 解析pcr反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備 包括配制配方及將各配方放于實(shí)驗(yàn)臺上 移液 混合 離心 反應(yīng) pcr儀是一種自動控制溫度的儀器 設(shè)計(jì)好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)了 答案 解析 4 近20年來 pcr技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段 其原理是利用dna半保留復(fù)制 在試管中進(jìn)行dna的人工復(fù)制 如圖 在短時(shí)間內(nèi) 將dna擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍 從而使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體 1 加熱使dna雙鏈間的鍵完全打開 稱為 而在細(xì)胞中是在酶的作用下進(jìn)行的 2 如果只需要大量克隆模板dna中間的某個(gè)特定區(qū)段 應(yīng)該加入種特定的引物 當(dāng)溫度降低至40 時(shí) 引物與兩條 舒展 的模板鏈的特定位置結(jié)合 在dna聚合酶的作用下 只能在引物的端連接脫氧核苷酸 兩條子鏈的延伸方向都是 3 pcr技術(shù)的必需條件 除了模板 原料 酶之外 至少還有三個(gè)條件 即液體環(huán)境 適宜的和 前者由自動調(diào)控 后者則靠來維持 4 通過pcr技術(shù)使dna分子大量復(fù)制 如果將一個(gè)用15n標(biāo)記的dna分子放入試管中 以14n標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料 連續(xù)復(fù)制四次之后 則15n標(biāo)記的dna分子占全部dna分子總數(shù)的比例是 答案 解析 問題導(dǎo)析 氫 解旋 解旋 兩 3 從子鏈的5 端向3 端延伸 溫度 酸堿度 pcr儀 緩沖液 1 8 問題導(dǎo)析 1 解旋是使dna雙鏈間的氫鍵斷裂 pcr技術(shù)是利用dna的原理 細(xì)胞內(nèi)是在酶的作用下解旋 2 dna分子不論復(fù)制幾次 含有15n標(biāo)記的dna分子都只有個(gè) 返回上頁 答案 熱變性 解旋 2 解析 1 pcr技術(shù)利用熱變性原理使dna雙鏈之間的氫鍵斷裂 稱為解旋 而在細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂 2 pcr分為三個(gè)基本反應(yīng)步驟 變性 94 98 復(fù)性 40 60 延伸 72 其特異性依賴于與靶序列互補(bǔ)的引物 引物是兩段與待擴(kuò)增dna序列互補(bǔ)的片段 兩引物之間的距離決定擴(kuò)增片段的長度 由于dna聚合酶不能從頭開始合成dna 只能從引物的3 端延伸dna鏈 則dna的合成方向總是從子鏈的5 端向3 端延伸 3 pcr技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)的dna復(fù)制不完全相同 除了需要模板 原料 酶以外 至少還需要液體環(huán)境 穩(wěn)定的緩沖溶液 每一個(gè)步驟需要適宜的溫度和酸堿度等 4 一個(gè)dna分子連續(xù)復(fù)制四次之后 形成16個(gè)dna分子 15n標(biāo)記的dna分子有2個(gè) 則15n標(biāo)記的dna分子占全部dna分子總數(shù)的比例為1 8 返回上頁 課堂小結(jié) 引物 復(fù)性 延伸 pcr儀 瓊脂糖凝膠電泳 當(dāng)堂檢測 1 用于pcr的引物長度通常為20 30個(gè)核苷酸 是一小段a dnab rnac 單鏈dna或rnad 雙鏈dna 2 3 4 5 1 答案 2 符合pcr反應(yīng)條件的一項(xiàng)是 穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境 dna模板 合成引物 四種脫氧核苷酸 dna聚合酶 dna解旋酶 限制性內(nèi)切酶 溫控設(shè)備a b c d 解析pcr反應(yīng)模擬的是生物細(xì)胞內(nèi)dna復(fù)制的條件 只是無需解旋酶 可熱變性 也不需要基因工程的工具酶 限制性內(nèi)切酶 答案 解析 2 3 4 5 1 3 下列關(guān)于pcr的描述中 正確的是 pcr是一種酶促反應(yīng) 引物決定了擴(kuò)增的特異性 擴(kuò)增dna利用了熱變性的原理 擴(kuò)增的對象是氨基酸序列a b c d 解析pcr是一種體外迅速擴(kuò)增dna片段的技術(shù) 在高溫條件下 把dna的雙鏈打開 緩慢冷卻后 又重新結(jié)合 需要耐高溫的dna聚合酶 同時(shí) 還需要引物 從引物的3 端連接脫氧核苷酸 答案 解析 2 3 4 5 1 4 下圖所示為pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物 請分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物 答案 2 3 4 5 1 解析 a 第一次循環(huán)b 第二次循環(huán)c 第三次循環(huán)d 第四次循環(huán) 2 3 4 5 1 解析在pcr反應(yīng)中 以引物為標(biāo)記 第一次循環(huán)時(shí) 以加入的dna為模板 兩條dna鏈可分別由引物 和引物 與其結(jié)合并在dna聚合酶的作用下延伸 所以形成的dna中只有一種引物 從第二次循環(huán)開始