實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞化學(xué)染色POX

細(xì)胞化學(xué)染色 滄州醫(yī)專醫(yī)學(xué)技術(shù)系侯振江 細(xì)胞化學(xué)染色 是一種以形態(tài)為基礎(chǔ) 結(jié)合運(yùn)用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)對(duì)血細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分作定位 定性及半定量分析的方法 用于研究血細(xì)胞生理 病理和化學(xué)結(jié)構(gòu) 臨床上為某些血液病的診斷 鑒別診斷 療效觀察 預(yù)后監(jiān)測(cè)和發(fā)病機(jī)制的探討 提供重要依據(jù) 血細(xì)胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu) 反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物 具有一定的穩(wěn)定性 血細(xì)胞化學(xué)染色可顯示糖原 脂類 酶 蛋白質(zhì)等 一 固定固定有物理法與化學(xué)法 物理法為干燥和火焰固定 化學(xué)法最常用的是甲醛 乙醇 丙酮和醋酸等 血細(xì)胞化學(xué)染色流程 二 顯示1 偶氮偶聯(lián)法 利用人工合成的酶底物 在酶作用下 產(chǎn)生分解產(chǎn)物 再與重氮鹽結(jié)合引起偶氮偶聯(lián) 使其形成不溶性的偶氮色素 以此證明酶的存在 2 聯(lián)苯胺法 粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶作用于過(guò)氧化氫 釋放新生態(tài)氧 使無(wú)色的聯(lián)苯胺形成藍(lán)色沉淀 3 普魯士藍(lán)法 細(xì)胞內(nèi) 外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用 形成藍(lán)色亞鐵氰化鐵沉淀 4 雪夫反應(yīng) 過(guò)碘酸氧化細(xì)胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成乙醛基 醛基與雪夫試劑作用 使無(wú)色品紅形成紅色沉淀 5 金屬沉著法其他尚有物理學(xué)方法 如脂溶性染料染色 顯示脂質(zhì) 熒光顯示 放射自顯影以及體外活體染色亦常用于臨床血液細(xì)胞學(xué)診斷 三 細(xì)胞化學(xué)定量粗略估量 以染色反應(yīng)的強(qiáng)弱 受色的深淺 人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽(yáng)性 百分法 只能反映細(xì)胞陽(yáng)性率 不能反映受色強(qiáng)弱 積分法 是常用的半定量法 將等級(jí)估量與百分率相結(jié)合它既反映了細(xì)胞陽(yáng)性率的高低 又反映了細(xì)胞受色的強(qiáng)弱 下面介紹幾種常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法這些方法學(xué)在白血病的鑒別診斷上具有重要意義 一 過(guò)氧化物酶染色 POX 一 四甲基聯(lián)苯胺法 TMB 原理 粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞漿內(nèi)的髓過(guò)氧化物酶 POXorMPO 分解過(guò)氧化氫 釋放新生態(tài)氧 使無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色聯(lián)苯胺 后者進(jìn)一步變成棕色化合物沉著于細(xì)胞質(zhì)內(nèi) POX 新生態(tài)氧 O 過(guò)氧化氫 基質(zhì)中 四甲基聯(lián)苯胺TMB 無(wú)色 聯(lián)苯胺藍(lán) 藍(lán)色 亞硝基鐵氰化鈉 藍(lán)色顆粒 漿內(nèi)酶部位 粒 單核細(xì)胞胞漿 原理 四甲基苯醌二胺 棕色 自我脫氫氧化 試劑 1 TMB亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液1 過(guò)氧化氫溶液稀過(guò)氧化氫溶液瑞氏染色液 操作 1 取0 1 TMB乙醇溶液lml 加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10 l 混合溶液呈淡棕黃色 2 在新鮮干燥的血片上 加混合溶液0 5ml 放置lmin后 再加稀過(guò)氧化氫溶液0 7ml 染色6min 3 瑞氏染液復(fù)染15 20min 4 油鏡鏡檢 結(jié)果 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有藍(lán)黑色顆粒者為陽(yáng)性 無(wú)顆粒沉著 顆粒細(xì)小 分布稀疏 顆粒較粗 局灶分布 顆粒粗大 分布較密 占胞質(zhì)1 2 2 3 顆粒粗大 呈團(tuán)塊分布 全部胞質(zhì)均部滿顆粒 可覆蓋胞核 骨髓片POX染色 臨床意義 1 粒系 POX主要分布在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi) 隨著粒細(xì)胞成熟的程度而逐漸增強(qiáng) 中性分葉核粒細(xì)胞為強(qiáng)陽(yáng)性 嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)性程度最強(qiáng) 其陽(yáng)性顆粒比中性粒細(xì)胞粗大 有折光 堿性粒細(xì)胞為陰性 2 單核細(xì)胞 原始單核細(xì)胞為陰性反應(yīng) 幼稚單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈弱陽(yáng)性反應(yīng) 顆粒細(xì)小 彌散分布 3 其他細(xì)胞淋巴細(xì)胞 漿細(xì)胞 幼紅細(xì)胞 組織細(xì)胞 巨核細(xì)胞均呈陰性反應(yīng) 4 血小板過(guò)氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細(xì)胞的核膜上 可作為原巨核細(xì)胞的一種標(biāo)志物 有助于FABM7的識(shí)別 5 過(guò)氧化物酶染色主要用于鑒別急性白血病類型 急性髓細(xì)胞白血病多呈陽(yáng)性反應(yīng) 以M3和M2型反應(yīng)最強(qiáng) MI和M5型反應(yīng)較弱 故有助于區(qū)別M3和M5型 急性淋巴細(xì)胞白血病呈POX陰性反應(yīng) 故為急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo) 注意事項(xiàng) 涂片應(yīng)新鮮制作 厚薄適宜 TMB配制在85 88 的乙醇溶液中染色效果較好 勿用90 95 乙醇 否則細(xì)胞表面蛋白質(zhì)很快凝固 妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而使顯色反應(yīng)減弱或消失 過(guò)氧化氫溶液需新鮮配制 其濃度與加入量不能隨意更改 涂片中粒細(xì)胞看不見陽(yáng)性顆粒 紅細(xì)胞呈棕色或綠色 即表示過(guò)氧化氫過(guò)濃 若過(guò)氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡 則示無(wú)效 染色液適宜pH值應(yīng)為5 5 若pH值 5 0會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果 試劑應(yīng)置于低溫暗處 防止光線照射失效 染色時(shí)加稀過(guò)氧化氫溶液之后必須與染色液充分混勻 否則同一片子上細(xì)胞染色情況不一致 AML M1 M1 POX 二 蘇丹黑B染色 原理 蘇丹黑B sudanblackB SB 是一種能溶解于脂肪中的色素染料 可使細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪 磷脂和類固醇著色 即使細(xì)胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)的脂類物質(zhì)也能顯示出來(lái) 試劑 1 10 甲醛液 2 蘇丹黑B乙醇溶液 操作 1 干燥血片或骨髓片在甲醛蒸氣中固定 2 自來(lái)水沖洗 3 放人染色液中 37 染色30 60min 4 用70 乙醇脫色1 2min 水洗lmin 5 瑞氏染液復(fù)染20 30min 結(jié)果 脂類呈黑色或棕黑色顆粒 定位于細(xì)胞漿中 顆粒很小 細(xì)小 稀疏 或胞質(zhì)局部面積的1 4有致密的顆粒 顆粒較少 或胞質(zhì)面積的1 2出現(xiàn)黑色顆粒 顆粒較密 或胞質(zhì)面積的3 4出現(xiàn)黑色顆粒 顆粒極密 顆粒間無(wú)間隙 臨床意義 1 粒細(xì)胞系早幼粒及以下階段隨著細(xì)胞成熟 陽(yáng)性顆粒逐漸增加 早期原粒細(xì)胞一般為陰性 少數(shù)細(xì)小點(diǎn)狀顆粒代表線粒體被染色晚期原粒細(xì)胞可出現(xiàn)陽(yáng)性顆粒 其顆粒限于胞漿的某一區(qū)域 2 單核細(xì)胞系陽(yáng)性 顆粒細(xì)小 分布彌散 形狀不規(guī)則 原單核細(xì)胞為陰性 3 紅細(xì)胞系 淋巴細(xì)胞系均呈陰性反應(yīng)4 尼曼一匹克細(xì)胞和戈謝細(xì)胞均為陽(yáng)性反應(yīng) 5 蘇丹黑B和過(guò)氧化物酶染色臨床意義相似 主要用于急性白血病類型的鑒別 蘇丹黑B染色較過(guò)氧化物酶染色更敏感 但特異性不如過(guò)氧化物酶染色 極少數(shù)急性淋巴細(xì)胞白血病可為陽(yáng)性 M1 SBB M2 SBB 三 過(guò)碘酸一雪夫 PAS 染色 原理 胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì) 如粘多糖 粘蛋白 糖蛋白 糖脂等 中的乙二醇基 CHOH CHOH 經(jīng)過(guò)碘酸 periodicacid 氧化 轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗?CHO CHO 與雪夫 Schiff 試劑中的無(wú)色品紅結(jié)合 形成紫紅色染料而沉積于胞漿中 該反應(yīng)稱為過(guò)碘酸一雪夫 PAS 陽(yáng)性反應(yīng) 結(jié)果 1 粒細(xì)胞系 原粒細(xì)胞多呈陰性反應(yīng) 也可弱陽(yáng)性 自早幼粒細(xì)胞以后隨著細(xì)胞的成熟程度 陽(yáng)性反應(yīng)逐漸增強(qiáng) 嗜酸粒細(xì)胞顆粒本身不著色 但顆粒間的胞質(zhì)呈彌漫性陽(yáng)性反應(yīng) 嗜堿粒細(xì)胞為陽(yáng)性反應(yīng) 顆粒紫紅色 大小不一 中性粒細(xì)胞糖原含量參考標(biāo)準(zhǔn) 胞質(zhì)無(wú)顆粒 胞質(zhì)呈淡紅色 無(wú)顆粒 胞質(zhì)呈紅色 有少量顆粒 胞質(zhì)呈暗紅色 顆粒較密 胞質(zhì)呈紫紅色 顆粒極密 過(guò)碘酸 Schiff反應(yīng) PAS 2 淋巴細(xì)胞系 大多數(shù)淋巴細(xì)胞呈陰性反應(yīng) 少數(shù)為 的陽(yáng)性反應(yīng) 淋巴細(xì)胞糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn) 胞質(zhì)內(nèi)無(wú)顆粒 胞質(zhì)內(nèi)有顆粒 有較粗紅色顆粒 有粗大紅色顆粒 顆粒粗大并有紅色塊狀 3 紅細(xì)胞系 幼紅細(xì)胞和紅細(xì)胞呈陰性反應(yīng)紅細(xì)胞系列糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn) 胞質(zhì)無(wú)顆粒 有少數(shù)紅色顆粒 有較粗紅色顆粒或彌漫紅色 有粗大紅色顆?；蛏罴t色 有粗大紅色塊狀或紫紅色 4 巨核細(xì)胞 巨核細(xì)胞和血小板染色反應(yīng)均為陽(yáng)性巨核細(xì)胞糖原含量程度參考標(biāo)準(zhǔn) 胞質(zhì)無(wú)顆粒 少量糖原包涵體 中等量糖原包涵體 定位于核膜出或分散胞質(zhì)中 占胞質(zhì)1 3 大量糖原包涵體分散于胞質(zhì)的1 2 糖原包涵體充滿整個(gè)胞質(zhì) PAS巨核細(xì)胞 巨核細(xì)胞包涵體 5 單核細(xì)胞呈陰性或陽(yáng)性 顆粒細(xì)小 往往位于胞質(zhì)邊緣 漿細(xì)胞大多呈陰性 少數(shù)為紅色顆粒陽(yáng)性 組織細(xì)胞為陰性反應(yīng) 巨噬細(xì)胞可呈陽(yáng)性 為紅色顆粒反應(yīng) 臨床意義 1 M6與巨幼貧的鑒別M6的幼紅細(xì)胞PAS可呈強(qiáng)陽(yáng)性 積分明顯增高 巨貧 再障 溶貧時(shí)PAS反應(yīng)為陰性 2 急性白血病的類型鑒別ALL PAS呈大塊狀陽(yáng)性 也可是陰性 AML為陰性 急性單核細(xì)胞白血病時(shí)原單核細(xì)胞及幼單核細(xì)胞PAS陽(yáng)性 積分增高 陽(yáng)性顆粒小而多 呈彌散分布 ALL L1 L1PAS AML M5 M5PAS AML M6 AML M6PAS AML M7 M7PAS 3 巨核細(xì)胞和Sternberg細(xì)胞鑒別巨核細(xì)胞PAS強(qiáng)陽(yáng)性 Sternberg細(xì)胞為陰性或弱陽(yáng)性 4 戈謝氏細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性 尼曼 皮克細(xì)胞陰性或弱陽(yáng)性 5 淋巴肉瘤 霍奇金病等 淋巴細(xì)胞的糖原積分增高 一般的病毒感染 糖原積分在正常范圍內(nèi) 四 中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色 偶氮偶聯(lián)法 Kaplow法 原理 中性粒細(xì)胞胞漿中的堿性磷酸酶在pH9 2 9 8緩沖液中 能水解磷酸萘酚鈉 并釋放出磷酸與萘酚 再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞漿中 結(jié)果 堅(jiān)牢藍(lán)RR陽(yáng)性為紫黑色顆粒 堅(jiān)牢紫醬GBC陽(yáng)性為棕紅色沉淀 一 陰性反應(yīng) 胞漿中無(wú)陽(yáng)性染色顆粒 胞漿中含有少量顆?；虺蕪浬\紅色 或彌散紫色 2 胞漿中含有中等量顆?；驈浬⑹苌?3 胞漿中有豐富的顆粒或彌散深色 胞核清晰 4 有極豐富的粗大顆粒 充滿胞漿 或彌散深色 胞核不清晰 中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶 NAP 偶氮偶聯(lián)法 NAP積分法計(jì)數(shù)100個(gè)成熟中性粒細(xì)胞 按其反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí) 各級(jí)百分率與其級(jí)數(shù)乘積的總和 即為積分 例如 NAP反應(yīng)結(jié)果 204020155積分 0 20 2 20 3 15 4 5 145參考值 正常人血細(xì)胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細(xì)胞 桿狀核及分葉核 可見陽(yáng)性外 其他血細(xì)胞均為陰性 中性粒細(xì)胞NAP活性積分值一般為10 50分 但有時(shí)可高達(dá)162分 臨床意義 1 生理變化 新生兒NAP增高 成人較兒童減低 老人更低 激烈運(yùn)動(dòng)增高 月經(jīng)期經(jīng)前增高 行經(jīng)后降低 經(jīng)后期恢復(fù)正常 妊娠期2 3月輕度增高 以后逐漸增高 分娩時(shí)達(dá)到高峰 產(chǎn)后恢復(fù)正常 2 病理變化增高 嚴(yán)重化膿性感染 類白血病反應(yīng) AA CML加速期 ALL CLL 惡性淋巴瘤 癌轉(zhuǎn)移 MM 真紅 骨髓纖維化等 減低 PNH CML 惡性組織細(xì)胞病 MDS 3 疾病鑒別診斷慢粒與類白的鑒別 CML減低 類白增高 急性白血病的鑒別 AML減低 ALL增高 PNH與AA鑒別 PNH減低 AA增高 病原微生物的鑒別 病毒感染減低 細(xì)菌感染增高 NAP CML NAP 五 骨髓鐵染色 原理 正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細(xì)胞中 骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用 形成普魯士藍(lán)反應(yīng) 形成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀 定位于含鐵的部位 從而反映骨髓中鐵的儲(chǔ)存量 化學(xué)反應(yīng)過(guò)程為 4Fe3 3K4 Fe CN 6 Fe4 Fe CN 6 3 12K 含鐵物質(zhì) 亞鐵氰化鉀 亞鐵氰化鐵 結(jié)果 1 細(xì)胞外鐵的觀察 細(xì)胞外鐵呈藍(lán)色的顆粒狀 小株?duì)罨驁F(tuán)塊狀 以油鏡觀察定級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 無(wú)鐵粒可見 少數(shù)鐵?；蜩F小珠 較多鐵粒和鐵小珠 很多鐵粒 鐵小珠和少數(shù)小塊 極多鐵粒 鐵小珠并有很多小塊 密集成堆 正常范圍 占2 3 占1 3 細(xì)胞外鐵 2 細(xì)胞內(nèi)鐵觀察 細(xì)胞內(nèi)鐵指有核紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒 以油鏡計(jì)100個(gè)中 晚幼紅細(xì)胞 記錄胞質(zhì)中含有藍(lán)色小顆粒 即鐵粒紅細(xì)胞 的比值 并根據(jù)細(xì)胞鐵顆粒的數(shù)目 大小 染色深淺和顆粒分布情況 將鐵粒幼紅細(xì)胞分為如下四型 型 僅含1 2個(gè)鐵顆粒 型 含3 4個(gè)鐵顆粒 型 含6 9個(gè)以上鐵顆粒 型 10個(gè)鐵顆粒 正常范圍 30 90 平均60 多見 型 少見 型 無(wú) 型 細(xì)胞內(nèi)鐵 3 環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞 指含鐵顆粒 6個(gè) 其中2 3以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形 正?；蚍氰F粒幼細(xì)貧血無(wú)環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞 鐵粒幼細(xì)貧血中環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞 6 環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞 臨床意義 1 缺鐵性貧血時(shí) 骨髓細(xì)胞外鐵明顯減少 為 一 士 細(xì)胞內(nèi)鐵平