石斛中多糖含量的測定.doc

陜西理工學(xué)院畢業(yè)論文題 目 石斛中多糖含量的測定 學(xué)生姓名 高 換 樓 學(xué)號 1111034082 所在學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 專業(yè)班級 化工1102班 指導(dǎo)教師 季 曉 暉 完成地點(diǎn) 陜西理工學(xué)院 2015 年 06 月 08 日石斛中多糖含量的測定高換樓（陜西理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 化工專業(yè)1102班，陜西 漢中 723001）季曉暉摘要 石斛為我國常用貴重藥材，有養(yǎng)陰清熱、益胃生津的功效，石斛一直備受國內(nèi)外研究者的重視。本文利用蒽酮-硫酸法對鐵皮石斛多糖的含量進(jìn)行了測定，并采用正交試驗(yàn)得到最佳實(shí)驗(yàn)方案，在石斛粉碎程度為粉末、液料比為50mL/g、提取2次，每次3小時(shí)的情況下多糖提取率最高。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后鐵皮石斛多糖提取的質(zhì)量評價(jià)及其進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。關(guān)鍵詞 石斛；多糖；蒽酮-硫酸法；抗氧化性；測定；Determination of Dendrobium polysaccharide contentGAO Huanlou（Grade 02, Class 11, Major chemical engineering, School of chemical and environmental science Dept, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 72300x, Shaanxi）Tutor: JI XiaohuiAbstract: Dendrobium is in common use in our country precious medicinal herbs, the effect of nourishing yin and clearing heat, nourishing stomach fluid, Dendrobium has attracted a lot of attention of researchers at home and abroad. The anthrone-sulfuric acid method of Dendrobium officinale polysaccharide content were measured, and using the orthogonal test and the optimum solution is obtained. In Dendrobium degree of comminution is in the form of powder, liquid to solid ratio for 50mL/1g, extraction 2 times, every time 3 hours of polysaccharides extraction rate was the highest. The experimental results for the quality evaluation of future Dendrobium officinale polysaccharide extraction and its further development and utilization to provide reference.Key words: Dendrobium; polysaccharide; anthrone-sulfuric acid method; antioxidation; determination;目錄1論文綜述11.1石斛生物堿11.2石斛多糖11.3鐵皮石斛的其他化學(xué)成分31.3.1氨基酸類51.3.2微量元素51.3.3木脂素類51.3.4酚酸類51.3.5苯丙素類61.3.6芪類其衍生物61.3.7菲類和聯(lián)芐類化合物71.4石斛的藥理作用71.4.1增強(qiáng)機(jī)體免疫作用71.4.2抗氧化作用71.4.3抗腫瘤作用71.4.4抗疲勞作用81.4.5降血糖作用81.4.6生津作用81.4.7其他藥理作用82實(shí)驗(yàn)82.1材料和試劑、儀器82.1.1儀器82.1.2材料及試劑92.2試驗(yàn)方法92.2.1預(yù)處理與純化過程92.2.2樣品制備及試劑配制92.2.3測定92.2.4鐵皮石斛多糖抗氧化性測定102.2.5多糖提取的正交試驗(yàn)102.2.3計(jì)算112.2.5結(jié)果與分析113結(jié)論134外文翻譯171論文綜述石斛是我國傳統(tǒng)常用名貴中藥材，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumS.w）多種植物的干燥莖的統(tǒng)稱。在我國已有2000多年的藥用歷史，早在神農(nóng)本草經(jīng)、本草綱目等著作中就有記載，并列居上品。著名的有金釵石斛（D.nobile Lindl）、鐵皮石斛（D.officinale Kimura et Migo）、霍山石斛（D.huoshanense）1等。目前我國76種石斛屬植物中，有近40種被作為藥用。傳統(tǒng)中醫(yī)常將其用于滋陰清熱、生津益胃、止咳潤肺、清音明目等2。現(xiàn)代藥理研究表明石斛具有多種醫(yī)藥功效，可預(yù)防和治療白內(nèi)障、增強(qiáng)免疫功能、治療腫瘤、降血糖、抗氧化等，在臨床中應(yīng)用相當(dāng)廣泛?；瘜W(xué)成分分析顯示，藥用石斛所含的化學(xué)成分類型多樣，包括生物堿、多糖、菲類、聯(lián)芐類、黃酮類、倍半萜類、香豆素、甾體及揮發(fā)油等3。1.1石斛生物堿生物堿是石斛藥材中最重要的活性成分之一，也是最早分離并進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)的化合物。1932年，日本人鈴木秀干在中藥金釵石斛（D.nobile）中首次分離獲得一種生物堿，命名為石解堿（Dendrobine）4。1935年，陳克恢等再次在金釵石斛中分離得到石斛堿，并測定金釵石斛中總生物堿的含量為0.52%5。1964年，犬伏康夫等確定石斛堿具有倍半萜骨架結(jié)構(gòu)6。迄今為止，已經(jīng)從16種石斛屬植物分離得到32種生物堿，主要骨架共分為四大類即石斛堿型、八氫中氮茚型、四氫比咯型和咪唑型7。石斛堿型石斛堿是石斛屬植物中存在最多的一類重要生物堿，共有19種；其基本骨架是含有15個(gè)C的picrotoxane型倍半萜；它含有一個(gè)五元內(nèi)酯環(huán)，N與picrotoxane倍半萜的2位與11位形成五元雜環(huán)，N上通常連有甲基等官能團(tuán)。按其骨架結(jié)構(gòu)變化，石斛堿型石斛堿又分為七種骨架類型7-10。1997年，臺灣學(xué)者Sha等首次通過-羰基游離基環(huán)化反應(yīng)全合成了純手性的石斛堿（）-dendrobine8。2000年，日本學(xué)者M(jìn)orita等從金釵石斛中分離得到一種很少見的五元內(nèi)酯開環(huán)的石斛堿型生物堿Mubironine C（C17H29O3N），其15位與3位的內(nèi)酯斷開。八氫中氮茚（octahydroindolizone）類7,10-12石斛堿是一種含有一個(gè)氮原子的五元和六元并環(huán)體系的生物堿，該類生物堿共有6種。四氫比咯型7,13-16生物堿共有5種，Leete等用放射性標(biāo)記化合物114C-醋酸鈉和4,214C鄰琥珀?；郊姿峒尤雸?bào)春石斛的生長過程，發(fā)現(xiàn)114C-醋酸鈉中的14C主要存于該類石斛堿的第5位C上，提出琥珀酰苯甲酸是其合成前體，Breuer等16以鄰羧基苯基環(huán)丙酮為原料水解得到了一種四氫比咯型生物堿石斛寧（shihunine）。咪唑型17,18生物堿有一個(gè)典型的咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)，該類生物堿有2種，1993年，Hemscheidt等18根據(jù)標(biāo)記的3C和15N研究其生物合成途徑，推測該類生物堿可由D,L-賴氨酸生物合成。前期研究報(bào)道，鐵皮石斛的生物堿含量只有金釵石斛的1/201。金釵石斛含較多生物堿，其一年生含量最高，為0.5489%，隨年份增加，其含量依次減少;鐵皮石斛中幾乎不含生物堿，三年生最高也僅含0.0121%3。此外，文獻(xiàn)報(bào)道野生石斛莖葉中總生物堿的含量僅有0.3%2，文中發(fā)現(xiàn)人工培植的金釵石斛中總生物堿含量高于野生品種，為0.5489%，因此，預(yù)測人工培植品將可替代野生品。鐵皮石斛中總生物堿含量較低，諸燕等19研究發(fā)現(xiàn)，人工栽培的鐵皮石斛與市場購買的鐵皮楓斗藥材總生物堿在0.0190%0.0430%；浙江省11個(gè)鐵皮石斛種質(zhì)一年生、二年生、三年生樣品平均總生物堿為0.0253%、0.0270%、0.0326%，云南產(chǎn)一年生鐵皮石斛平均總生物堿為0.0343%。1.2石斛多糖石斛多糖是石斛類中藥材的主要有效成分，為大分子化合物，是鐵皮石斛的主要藥效成分。目前對中藥多糖的分析以含量和單糖組成分析為主，特別是后者，在分析儀器的普及、色譜及色譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展等因素的推動下，已經(jīng)成為2010年版藥典鐵皮石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法之一。多糖類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜：一級結(jié)構(gòu)主要反映糖鏈的糖基組成、各種組成單糖的分子數(shù)比例、單糖殘基的構(gòu)型、殘基之間的連接次序等內(nèi)容，單糖殘基的排列順序?qū)Χ嗵堑幕钚杂杏绊懀欢壗Y(jié)構(gòu)反映多糖骨架鏈的構(gòu)象；三級結(jié)構(gòu)反映了單糖殘基中各官能團(tuán)之間非共價(jià)作用形成的有序、規(guī)則而粗大的空間構(gòu)象；四級結(jié)構(gòu)指多聚鏈間非共價(jià)鍵結(jié)合形成的聚集體。多糖的高級結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。目前鐵皮石斛多糖研究以含量測定和一級結(jié)構(gòu)研究為主，在此基礎(chǔ)上2010年版中國藥典制定了專屬性更強(qiáng)的鐵皮石斛鑒別和含量測定方法；同時(shí)，鐵皮石斛多糖的指紋圖譜分析、高級結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系、生物化學(xué)等方面的研究還有待繼續(xù)深入地開展。相信隨著色譜、電泳等現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)在生物大分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)分析中、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在化學(xué)成分定性、定量分析中的廣泛應(yīng)用，鐵皮石斛多糖的活性成分及結(jié)構(gòu)功能通過相關(guān)藥效學(xué)的研究將能夠得到明確的界定。在此基礎(chǔ)上，鐵皮石斛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)會有質(zhì)的提高20。多糖其含量多少是評價(jià)藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。王建21等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，廣西6個(gè)產(chǎn)地的馬鞭石斛中多糖的含量差異較大，其中以田陽縣的馬鞭石斛的多糖含量最高，達(dá)11.85%，其他產(chǎn)地的馬鞭石斛多糖含量分別為10.93%、10.08%、4.18%、4.39%、5.20%。因石斛為多年生植物，有效成分的積累與其生長年限、生長環(huán)境等都存在著密切的聯(lián)系。不同產(chǎn)地的馬鞭石斛之間多糖含量差別較大，可能與以上因素有一定的關(guān)系。諸燕等19研究浙江人工栽培的鐵皮石斛，發(fā)現(xiàn)二年生鐵皮石斛多糖平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)34.47%；不同種質(zhì)、生理年齡的鐵皮石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異。李彩霞20比較不同采收期鐵皮石斛多糖含量，春季（3月）、夏季（6月）、秋季（9月）和冬季（12月）的鐵皮石斛多糖含量分別為4.59%、5.37%、5.92%和6.24%，以冬季采收為佳。尚喜雨23對鐵皮石斛的組培苗、野生植株、栽培植株中多糖的含量及分布進(jìn)行系統(tǒng)分析和研究，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛的多糖含量很高，尤以莖段為最多；不同部位的含量存在一定差異，莖部的差異大于根和葉；人工栽培的兩年生植株的多糖含量比一年生的多，野生型的比栽培型的多；殺青后烘干處理可以有效地減少多糖在處理過程中的損失。在前人研究基礎(chǔ)上，近10年從鐵皮石斛中分離得到更多的多糖。楊虹等24分離得到兩個(gè)多糖，即DT2和DT3，分子量分別為7.410.5和5.410.5；DT2和DT3的結(jié)構(gòu)主要以-（14）-D-Glc縮合而成，末端糖為1Gal，1Glc及1Ara，葡萄糖和半乳糖上含有少量的分支，并含少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖。Hua等25分離得到一個(gè)結(jié)構(gòu)為O-乙酰葡萄甘露聚糖類型的多糖，主鏈由-（14）-甘露型吡喃糖基和-吡喃葡萄糖基重復(fù)構(gòu)成，支鏈由（13）-甘露糖基、（13）-葡萄糖基和少量的阿拉伯呋喃糖基組成，支鏈連接在主鏈末端糖基的6位上；（14）-甘露糖基和葡萄糖基的2位被乙?；?；單糖組成為甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖按40.28.41的摩爾比例組成。何鐵光等26從鐵皮石斛原球莖分離得到均一組分多糖DCPP3c-1，相對分子質(zhì)量為72.4，由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其分子物質(zhì)的量之比為1.120411.04623.3543.8281.046，DCPP3c-1中16鍵連接的殘基占14.0%，12或14鍵連接的殘基占40.7%，13鍵連接的殘基占45.3%。鐵皮石斛多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)見表1.127。表1.1 從鐵皮石斛中分離得到的多糖序號多糖名稱分子量單糖組成參考文獻(xiàn)黑節(jié)草多糖1000000甘露糖型吡喃糖、露糖型吡喃糖、喃糖、葡萄糖、其他戊糖28黑節(jié)草多糖5000000甘露糖型吡喃糖、露糖型吡喃糖、喃糖、葡萄糖、其他戊糖28黑節(jié)草多糖1200002甘露糖型吡喃糖、露糖型吡喃糖、喃糖、葡萄糖、其他戊糖282-O-乙酰葡萄糖甘露聚糖甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖（40.48.41）29DT2740000葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖（5.91.00.80.5）30DT3540000葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖（7.91.31.00.50.7）30DCPP1a-1189000甘露糖、葡萄糖（7.0151）31多糖含量測定的方法有很多。一類是利用多糖的還原性，如3,5-二硝基水楊酸鹽比色法和Somogyi-Nelson法；另一類是普遍使用的利用多糖在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)這一性質(zhì)進(jìn)行測定，如苯酚-硫酸法和蒽酮硫酸法32。苯酚-硫酸法是常用測定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單、靈敏度高，試驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響。蒽酮-硫酸法幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以用該法測出的多糖含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。1.3鐵皮石斛的其他化學(xué)成分利用先進(jìn)的檢測技術(shù)對中藥材或其來源植物的化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的方法實(shí)現(xiàn)對中藥的基源鑒定20，陳曉梅等利用此方法對鐵皮石斛莖中分離鑒定，其中所含化合物如表1.2所示。表1.2 鐵皮石斛莖中分離鑒定的化合物化合物類別化合物成分參考文獻(xiàn)芪類鐵皮石斛素 Adendrocandin A33鐵皮石斛素 Bdendrocandin B33鐵皮石斛素 Cdendrocandin C34鐵皮石斛素 Ddendrocandin D34鐵皮石斛素 Edendrocandin E34鐵皮石斛素 Fdendrocandin F35鐵皮石斛素 Gdendrocandin G35鐵皮石斛素 Hdendrocandin H35鐵皮石斛素 Idendrocandin I354,4-二羥基-3,5-二甲氧基聯(lián)芐4,4-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl333,4-二羥基-5,4-二甲氧基聯(lián)芐3,4-dihydroxy-5,4-dimethoxybibenzyl333-羥基-3,4,5-三甲氧基聯(lián)芐3-O-methylgigantol334,4-二羥基-3,3,5-三甲氧基聯(lián)芐dendrophenol333,4-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐3,4-dihydroxy-5-methoxybibenzyl363,4-二羥基-3,5-二甲氧基聯(lián)芐gigantol33二氫白藜蘆醇dihydroresveratrol36dendromoniliside E36denbinobin362,4,7-三羥基-9,10-二氫菲2,4,7-trihydroxy-9,10-dihydrophenanthrene364,5-二羥基-3,3-二甲氧基聯(lián)芐4,5-dihydroxy-3,3-dimethoxybibenzyl372,3,4,7-四甲氧基菲2,3,4,7-tetramethoxyphenanthrene381,5-二羧基-1,2,3,4-四甲氧基菲nakaharain382,5-二羥基-3,4-二甲氧基菲2,5-dihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene382,7-二羧基-3,4,8-三甲氧基菲Confusarin382,5-二羧基3,4-二甲氧基菲nudol383,5-二羧基-2,4-二甲氧基菲bulbophyllanthrin38酚類N-p-香豆酰酪胺paprazine39反-N-(4-羥基苯乙基)阿魏酸酰胺moupinamide39二氫松柏醇二氫對羥基桂皮酸酯dhydroconiferyl dihydro-p-cumarate39二氫阿魏酰酪胺dihydro-feruloyltyramine39對羥基苯丙酰酪胺p-hydroxyphenylpropionyl tyramine39丁香酸syringic acid39丁香醛syringaldehyde39香草酸vanillic acid39對羥基苯丙酸p-hydroxy-phenylpropionic acid37,39對羥基桂皮酸p-hydroxy cinnamic acid37,39阿魏酸ferulic acid39對羥基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid39松柏醇3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propen-1-ol37香草醇4-hydroxy-3-methoxybenzyl alcohol37穆坪馬兜鈴酰胺N-trans-feruloyl tyramine37順式阿魏酰對羥基苯乙胺37反式桂皮酰對羥基苯乙胺37木質(zhì)素類(+)-丁香脂素-O-D-吡喃葡萄糖苷(+)-syringaresinol-D-glucopyranoside40Icariol A2-4-O-D-glucopyranoside40(+)-lyoniresinol-3a-O-D-glucopyranoside40裂異落葉松脂醇()-secoisolariciresinol40左旋丁香脂素()syringaresinol37,40丁香脂素-4,4-O-雙-D-葡萄糖苷syringaresinol-4,4-O-bis-D-glucoside40二氫丁香苷Dihydrosyringin39酚苷類koaburaside393,4,5-三甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷khaephuouside404-羥基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷leonuriside A402-甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷2-methoxyphenyl-1-O-D-apiofuromosyl-(11-ap-D-glucopyranoside404-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷37金盞花苷Erigeside ,dictamnoside A39核苷類腺苷adenosine36尿苷uridine36鳥苷guanosine36內(nèi)酯類鉤狀石斛素aduncin36洋地黃內(nèi)酯,金盞菊花素digiprolactone,calendin36黃酮類柚皮素,4,5,7-三羥基二氫黃酮naringenin37,393,5,5,7-四羥基二氫黃酮3,5,5,7-tetrahydroxyflavanone39甾類胡蘿卜苷daucosterol36-谷甾醇-sitosterol36脂肪酸酯反式阿魏酸二十八烷基酯n-octacostyl ferulate36對羥基反式肉桂酸三十烷基酯defuscin36對羥基順式肉桂酸三十烷基酯n-triacontyl cis-p-coumarate36脂肪酸十六烷酸hexadecanoic acid36十七烷酸heptadecanoic acid36脂肪醇三十一烷醇hentriacontane36苯丙素苷（1R）-1-（4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙醇-4-O-D-葡萄糖苷(1R)-1-(4-hydroxy-3,5-dimethoxylphenyl)propan-1-ol-4-O-D-glucopyranoside40糖類蔗糖sucrose36其他5-羥甲基糠醛5-hydroxymethyl-furaldehyde36在植物化學(xué)研究方面，李燕等33-35,37,41從鐵皮石斛莖中分離鑒定了27個(gè)聯(lián)芐類化合物。楊莉等42報(bào)道，用HPLC分析了31種石斛屬植物（不包括鐵皮石斛）中的11個(gè)酚性成分（包括聯(lián)芐化合物5個(gè)，菲和芴酮化合物各3個(gè)），發(fā)現(xiàn)聯(lián)芐化合物在石斛屬植物中普遍存在，其中3,4-二羥基-3,5-二甲氧基聯(lián)芐（gigantol）和4,4-二羥基-3,3,5-三甲氧基聯(lián)芐（moscatilin）在檢測植物中的分布最廣。陳曉梅等43分析了包括鐵皮石斛在內(nèi)的24種石斛屬植物62份樣品的化學(xué)成分，得到了類似的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛的聯(lián)芐含量高于人工栽培的，說明人工栽培鐵皮石斛中小分子化學(xué)成分的積累與野生鐵皮石斛的存在差別。聯(lián)芐成分在鐵皮石斛樣品中的含量均較低，3,4-二羥基-4,5-二甲氧基聯(lián)芐的平均含量最高，僅為0.05；且目前還沒有關(guān)于該化合物藥理活性研究的報(bào)道。研究聯(lián)芐成分與鐵皮石斛功效的關(guān)系，將有助于明確鐵皮石斛的藥效成分，提高藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)陳曉梅等43的報(bào)道，采集自云南省、浙江省和貴州省的12個(gè)鐵皮石斛樣品中均能檢測到柚皮素（4,5,7-三羥基黃烷酮，naringenin）和3,4-二羥基-4,5-二甲氧基聯(lián)芐。此外，這兩個(gè)成分在石斛屬植物中也有較廣泛的分布：柚皮素在20種植物的56份樣品中存在；3,4-二羥基-4,5-二甲氧基聯(lián)芐在13種植物的40份樣品中存在。以植物樣品中柚皮素、3,4-二羥基-4,5-二甲氧基聯(lián)芐、gigantol和moscatilin等4個(gè)化合物含量、多糖含量、以及多糖的單糖組成中甘露糖和葡萄糖相對含量比（M/G）為預(yù)測變量，利用多元統(tǒng)計(jì)分析的判別分析（discriminant analysis）建立判別函數(shù)，能將鐵皮石斛與4種近似植物：晶帽石斛、齒瓣石斛、兜唇石斛和束花石斛完全區(qū)別開來。這一結(jié)果同時(shí)說明柚皮素、聯(lián)芐和多糖等化學(xué)成分對石斛屬植物的鑒別有重要意義。引入多種類型化學(xué)成分的指標(biāo)進(jìn)行判別分析，有助于提高研究對象分類的準(zhǔn)確性。1.3.1氨基酸類鐵皮石斛含有天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸等16種氨基酸，前5種占總氨基酸的53，含有除色氨酸以外的所有人體必須的氨基酸44。人工培養(yǎng)鐵皮石斛圓球體及分化苗中含有除上述16種氨基酸外，還含苯丙氨酸，其中7種是人體必需但又不能自身合成的氨基酸45。1.3.2微量元素諸燕等19測定鐵皮石斛中11種金屬元素含量，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛中鉀、鈣、鎂、錳、鋅、鉻和銅平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1205.23、766.82、158.25、31.06、4.28、8.28、0.97mg/kg，砷、汞、鉛和鎘4種重金屬元素含量，除1個(gè)樣品鎘元素超過限量指標(biāo)0.07mg/kg外，均在規(guī)定限度范圍內(nèi)，并且種質(zhì)與生理年齡對金屬元素的積累存在顯著影響46。在人工鐵皮石斛、原球莖組織培養(yǎng)物、鐵皮楓斗與鐵皮石斛膠囊中，10種主要微量元素Cu、Zn、Fe、Mn、Ca、Mg、K、Cr、Sr、B含量非常相近47。且原球莖組織培養(yǎng)物的9種微量元素（除Cu外）含量均最高。由此提示，以滋補(bǔ)作用為研究方向，鐵皮石斛具有巨大的開發(fā)價(jià)值。1.3.3木脂素類已報(bào)道44,48(+)-丁香脂素-O-D-吡喃葡萄糖苷、icariol A2-4-O-D-glucopy-ranoside、(+)-lyoniresinol-3a-O-D-glucopyranoside、裂異落葉松脂醇、丁香脂素-4,4-O-雙-D-葡萄糖苷和丁香脂素等木脂素類化合物。1.3.4酚酸類已報(bào)道41,48-51koaburaside、丁香酸、丁香醛、香草酸、對羥基苯甲酸、松柏醇、香草醇、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷、2-甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷、3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-D-芹糖-(12)-D-葡萄糖苷和(1R)-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙醇-4-O-D-葡萄糖苷等酚酸類化合物。1.3.5苯丙素類已發(fā)現(xiàn)41,48(E)-對羥基苯丙酸、對羥基桂皮酸、反式桂皮酸酰對羥基苯乙胺、順式阿魏酸酰對羥基苯乙胺、阿魏酸、dictamnoside A、反式阿魏酸二十八烷基酯、對羥基反式肉桂酸三十烷基酯、對羥基順式肉桂酸三十烷基酯、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷和二氫松柏醇二氫對羥基桂皮酸酯等苯丙素類化合物。1.3.6芪類其衍生物從石斛中分離出來的芪類化合物主要包括聯(lián)芐、二氮雜菲等，其藥理活性主要為抗腫瘤。目前從鐵皮石斛中分離鑒定的芪類化合物有：雙芐酚類及菲酚類化合物毛蘭素（erianin）和鼓槌菲（chysotoxene）；菲醌母核金釵石斛菲醌（denbinobin）52；聯(lián)芐類化合物dendrocandinA，dendrocandin B，dendrocandin C，dendrocandinD和dendrocandin E534,4-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl，3,4-dihydroxy-5,4-dimethoxybibenzyl，3-O-methylgigantol，dendrophenol和石斛酚（gigantol）54。上述化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)見表1.3、圖1.1。表1.3 鐵皮石斛中芪類化合物結(jié)構(gòu)類型化合物名稱結(jié)構(gòu)參考文獻(xiàn)菲酚類chysotoxene55聯(lián)芐類Erianin55菲醌類denbinobin52聯(lián)芐類dendrocandin A：R1=R2=OH.R3=R5=R6=OCH3.R4=H53聯(lián)芐類dendrocandin B53聯(lián)芐類dendrocandin C：R1=R2=R5=OH,R3=R6=OCH3.R4=H54聯(lián)芐類dendrocandin D：R1=R2=R5=OH,R3=OCH3,R6=OCH3,R4=H54聯(lián)芐類dendrocandin E：R1=R2=R4=R5=OH,R3=OCH3,R6=H54聯(lián)芐類4,4-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl：R2=R5=OH,R1=R3=OCH3,R4=R6=H53聯(lián)芐類3,4-dihydroxy-5,4-dimethoxybibenzyl：R1=R2=OH,R3=R5=OCH3,R4=R6=H53聯(lián)芐類3-O-methylgigantolIV：R1=OH,R3=R4=R5=OCH3,R2=R6=H53聯(lián)芐類dendrophenolIV：R2=R4=R5=OH,R1=R3=OCH3.R6=H53聯(lián)芐類gigantolIV：R1=R5=OH,R3=R4=OCH3,R2=R6=H53圖1.1 鐵皮石斛中芪類化合物母核1.3.7菲類和聯(lián)芐類化合物李榕生等56從鐵皮石斛乙醇提取物中得到6個(gè)化合物：2,3,4,7-四甲氧基菲、1,5-二羧基-1,2,3,4-四甲氧基菲、2,5-二羥基-3,4-二甲氧基菲、2,7-二羧基-3,4,8-三甲氧基菲、2,5-二羧基-3,4-二甲氧基菲、3,5-二羧基-2,4-二甲氧基菲。李燕等41分離得到denbinobin、2,4,7-三羥基-9,10-二氫菲。管惠娟和Li等48,53,57,58發(fā)現(xiàn)4,5-二羥基-3,3-二甲氧基聯(lián)芐，鐵皮石斛素A、C、D、E、F、G、J、K、H、L、B、M、N、O、I、P、Q、R，4,4-二羥基-3,5-二甲氧基聯(lián)芐，3,4-二羥基-5,4-二甲氧基聯(lián)芐，3-羥基-3,4,5-三甲氧基聯(lián)芐，4,4-二羥基-3,3,5-三甲氧基聯(lián)芐，3,4-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐，3,4-二羥基-3,5-二甲氧基聯(lián)芐，二氫白黎蘆醇和dendromoniliside E等27個(gè)聯(lián)芐類化合物。1.4石斛的藥理作用1.4.1增強(qiáng)機(jī)體免疫作用鐵皮石斛顆粒（TPSH）可促進(jìn)荷瘤動物巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化及NK細(xì)胞的活性，并能明顯提高荷瘤動物的血清溶血素值，提示TPSH無論是對非特異性免疫功能，或是特異性細(xì)胞免疫以及體液免疫功能，均有一定的提高作用49。鐵皮石斛多糖對S180實(shí)體瘤均有一定的抑制作用，其抑瘤率為9.7%26.8%，并且鐵皮石斛多糖對S180肉瘤小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、NK活性、巨噬細(xì)胞吞噬功能及溶血素值均有明顯提高作用59。楊明晶等60選擇低、中、高劑量的鐵皮楓斗西洋參膠囊（58、117、350mg/kg），調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，發(fā)現(xiàn)每天補(bǔ)充中、高劑量的鐵皮楓斗西洋參，30d后小鼠的細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)。1.4.2抗氧化作用何鐵光等26研究證明，鐵皮石斛原球莖多糖組分DCPP1a-1能有效地清除超氧陰離子和OH，并能抑制小鼠肝勻漿及肝線粒體丙二醛（MDA）的生成和肝線粒體腫脹。鮑素華等61研究發(fā)現(xiàn)不同相對分子質(zhì)量的多糖，在不同抗氧化體系中，其抗氧化活性差異顯著，DSP對OH清除作用強(qiáng)于其他多糖；DSP1對DPPH的清除率、抑制Fe2+-VC誘導(dǎo)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化能力、抑制H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血能力和總抗氧化能力最佳；DSP2抗氧化能力最弱。鐵皮石斛多糖分子質(zhì)量小于3.53104u或大于7.44104u時(shí)抑制DNA損傷的生物活性較高，且明顯強(qiáng)于VC。湯小華等62研究發(fā)現(xiàn)鮮鐵皮石斛（3g/kg）和鐵皮楓斗（0.5、0.90、1.35g/kg）均能提高血清和肝中超氧化物歧化酶（SOD）、肝谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，鮮鐵皮石斛（6g/kg）能提高血清SOD、肝GSH-Px；鮮鐵皮石斛（3、6g/kg）和鐵皮楓斗（0.45、0.90g/kg）均能降低血清和肝MDA；鮮鐵皮石斛（9g/kg）能降低血清MDA；鐵皮石斛和鐵皮楓斗對急性酒精性肝損傷模型小鼠具有抗氧化作用。鐵皮石斛水提物、大豆異黃酮提取物及二者合用對正常小鼠紅細(xì)胞SOD活力的影響均無顯著差異（P0.05）；但可顯著提高小鼠肝組織中SOD活性和降低MDA含量，聯(lián)合用藥對小鼠肝臟SOD活性增效系數(shù)Q值為1.44，說明鐵皮石斛水提物與大豆異黃酮提取物具有協(xié)同抗氧化作用63。1.4.3抗腫瘤作用馬國祥等64分析石斛中的18個(gè)種，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛含有鼓槌菲（chrysotoxene）和毛蘭素（erianin），這兩個(gè)菲類化合物具有對肝癌和艾氏腹水癌細(xì)胞抑制活性。李燕41進(jìn)行抗腫瘤活性的初步篩選，發(fā)現(xiàn)聯(lián)芐類化合物4,4-二羥基-3,5-二甲氧基聯(lián)芐對人卵巢癌細(xì)胞株（A2780）有活性，4,4-二羥基-3,3,5-三甲氧基聯(lián)芐對人胃癌細(xì)胞株（BGC-823）和人卵巢癌細(xì)胞株（A2780）有活性。鐵皮楓斗多糖、菲類、聯(lián)芐類化合物具有抗腫瘤活性及抗多藥耐藥性，能抑制多種人體腫瘤細(xì)胞株增殖。鐵皮石斛多糖聯(lián)合rIL-2，顯著增強(qiáng)臍帶血和腫瘤病人外周血LAK細(xì)胞體外殺傷作用，通過LAK/rIL-2免疫作用治療惡性腫瘤。毛蘭素(erianin)對小鼠肝癌抑瘤率為50.82%，對腫瘤細(xì)胞株K562生長的抑制作用，隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。臨床觀察也發(fā)現(xiàn)65，鐵皮楓斗晶、鐵皮楓斗顆粒（膠囊）是放化療腫瘤患者對癥輔助治療的有效藥物，能顯著減輕放療副反應(yīng)。多糖和芪類化合物的抗腫瘤活性，提示鐵皮石斛不僅可以用于癌癥對癥治療的輔助用藥，亦可作為抗腫瘤藥物研究開發(fā)的候選物。1.4.4抗疲勞作用石斛洋參沖劑能使異丙腎上腺素處理小鼠游泳時(shí)間延長、增加小鼠耐缺氧能力，提高甲亢型小鼠存活率。鐵皮楓斗晶能維持運(yùn)動小鼠肝糖原含量，明顯降低運(yùn)動后血清尿素氮和血乳酸含量，均表現(xiàn)明顯的抗疲勞作用66。1.4.5降血糖作用吳昊姝等67對鐵皮石斛浸膏的降血糖作用及其機(jī)制研究表明，鐵皮石斛浸膏對正常小鼠血糖及血清胰島素水平無明顯影響，但可使鏈脲佐菌素性糖尿病大鼠的血糖值降低、血清胰島素水平升高、胰高血糖素水平降低，還可通過增加大鼠胰島素細(xì)胞，減少細(xì)胞，修復(fù)鏈脲霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，進(jìn)而升高血清胰島素、降低胰高血糖素水平。鐵皮石斛也可通過抑制肝糖原分解和促進(jìn)肝糖原合成，減少血糖來源，增加血糖去路，影響腎上腺素性高血糖小鼠血糖和肝糖原水平。陳愛君等68發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛膏3g（生藥）/kg劑量灌胃給藥可降低四氧嘧啶所致糖尿病模型小鼠的血糖值，并明顯改善該模型小鼠的糖耐量，減少其血糖曲線下面積。1.4.6生津作用鐵皮石斛的生津作用，主要表現(xiàn)為促進(jìn)腺體分泌和臟器運(yùn)動27。對消化系統(tǒng)作用：最初研究表明，鐵皮石斛和西洋參合用不僅能促進(jìn)正常家兔的唾液分泌。還能拮抗阿托品對家兔唾液分泌的抑制作用。鐵皮石斛單用能促進(jìn)大鼠胃液分泌、小腸推進(jìn)運(yùn)動和小鼠排糞功能。其機(jī)制與抑制細(xì)胞膜上的Na+/K+ ATP泵有關(guān)69。臨床應(yīng)用也證實(shí)，鐵皮石斛可以顯著改善口腔氣管插管患者口腔潰瘍愈合率70。進(jìn)一步證實(shí)了鐵皮楓斗晶能養(yǎng)陰益胃生津，維護(hù)消化系統(tǒng)功能。對呼吸系統(tǒng)的作用：與前期鐵皮石斛提取物結(jié)果相同，鐵皮楓斗晶能顯著促進(jìn)小鼠氣管酚紅排泌和家鴿氣管內(nèi)墨汁運(yùn)動速度，抑制氨水引起的小鼠咳嗽。顯示明顯的祛痰和鎮(zhèn)咳作用71。1.4.7其他藥理作用鐵皮石斛提取物對易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠（SHR-sp）具有緩和持久的降壓作用，并且其降壓作用與用量有一定相關(guān)性72；對SHR-sp大鼠具有延長生存時(shí)間、提高生存率、預(yù)防中風(fēng)的作用，并且鐵皮石斛提取物與西藥尼莫地平合用對SHR-sp大鼠能較好地延長生存時(shí)間、提高生存率、預(yù)防中風(fēng)73。鹿偉等74對小鼠經(jīng)口灌胃不同劑量鐵皮石斛樣品30d，與陰性對照組相比，鐵皮石斛樣品3個(gè)劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間均顯著延長，血乳酸和肌酸激酶含量均顯著降低，鐵皮石斛在提高運(yùn)動耐力的同時(shí)，能顯著加快代謝產(chǎn)物的清除，同時(shí)通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)疲勞的盡快恢復(fù)。黃琴等75研究得出鐵皮石斛胚狀體各劑量組（0.2、0.4、0.8g/kg）可以在人體跑步30min后提高血糖含量并降低全血乳酸含量，中、高劑量組可以降低運(yùn)動后肝糖元及肌糖元的消耗，各劑量組均能明顯降低血尿素氮的含量。鐵皮石斛生境獨(dú)特，對氣候要求十分嚴(yán)格，自然成活率極低，野生資源瀕臨枯竭76。1987年國家將鐵皮石斛列為重點(diǎn)保護(hù)野生珍稀藥材品種，第1批中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄將鐵皮石斛列入其中，瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約也將其列為瀕危和特別需要關(guān)注的藥用植物加以保護(hù)77。近年來，石斛屬植物資源極其緊缺，某些種已瀕臨滅絕。而鐵皮石斛的市場需求持續(xù)旺盛，但其野生資源有限，加之鐵皮石斛生境不斷遭受破壞，導(dǎo)致鐵皮石斛野生資源瀕臨滅絕，無法滿足市場需求。因此，應(yīng)設(shè)法提高鐵皮石斛多糖提取率。基于此，本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)探討鐵皮石斛多糖的最佳提取工藝條件，對石斛粉碎程度、液料比、多糖提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，確定最優(yōu)提取參數(shù)。2實(shí)驗(yàn)2.1材料和試劑、儀器2.1.1儀器電子天平：AL204-IC，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；低速臺式離心機(jī)：800型，上海手術(shù)器械廠；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D（），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：JXL-2S-6A，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司；中草藥粉碎機(jī)：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；研缽、研磨棒；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-2000A型，上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)：722G型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。燒杯；量筒；刻度試管；圓底燒瓶；回流管。2.1.2材料及試劑干燥的鐵皮石斛顆粒；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：含量98%，批號為20150303，上海金穗生物科技有限公司；蒽酮；硫酸；無水乙醇；水為蒸餾水。2.2試驗(yàn)方法采用硫酸-蒽酮比色法測定其多糖含量，在620nm處使用紫外-可見分光光度計(jì)測定吸收度； 2.2.1預(yù)處理與純化過程精密稱取鐵皮石斛干燥粉末（過孔徑為0.354mm篩）1.000g，置圓底燒瓶中。用70mL乙醇（95%）加熱回流2次除去雜質(zhì)，每次一小時(shí)。設(shè)置反應(yīng)條件液（mL）料（g）比為65：1、提取時(shí)間為2h、提取2次，在90熱水下回流提取。提取之后過濾，將濾液置250mL容量瓶中定容，得石斛多糖粗提液。分別精密量取1mL定容后的濾液置10mL離心管中，加入9mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，搖勻，冷藏1h，取出，以4000r/min離心15min，所得沉淀加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗滌2次，每次10mL，棄去上清液，沉淀用熱蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，放冷后加水至刻度，搖勻，即得鐵皮石斛多糖浸提液21。2.2.2樣品制備及試劑配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25mg置于250mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配置成0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。蒽酮-硫酸溶液的制備（現(xiàn)配現(xiàn)用）：精密稱取蒽酮0.1g，加80%的硫酸溶液100mL使溶解，搖勻，放置于棕色瓶中，冷藏。2.2.3測定1）測定原理采用蒽酮-硫酸比色法測定其多糖含量，在620nm處使用紫外-可見分光光度計(jì)測定吸收度。2）測定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密吸取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液5ml、20ml、50ml、80ml置于100ml容量瓶中，各加蒸餾水至刻度，將溶液稀釋為5、20、50、80g/mL。精密量取上述各濃度的溶液及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液2.0mL于10mL具塞試管中，精密加入蒽酮硫酸溶液6.0mL，置水浴加熱15min，取出，迅速冰浴冷卻15min，室溫放置5min左右，以蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照，按照紫外-可見分光光度法，測定625nm處吸光度。以濃度（C）（g/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2.1所示）。得回歸方程y=0.0007x+0.0121，相關(guān)系數(shù)R=0.9945。表明葡萄糖濃度在5100g/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。圖2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品測定：精密量取本實(shí)驗(yàn)制得的石斛多糖浸提液2mL于10mL具塞試管中，精密加入蒽酮硫酸溶液6.0mL，置水浴加熱15min，取出，迅速冰浴冷卻15min，室溫放置5min左右，以加水試劑空白對照，按照紫外-可見分光光度法，測定625nm處吸光度。記錄吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得知對應(yīng)的葡萄糖含量。2.2.4鐵皮石斛多糖抗氧化性測定羥基自由基的清除（Fenton78反應(yīng)）大量研究表明，羥基自由基（OH）具有極強(qiáng)的氧化能力，它能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷，對生物組織產(chǎn)生極強(qiáng)的危害作用。本試驗(yàn)通過Fenton法研究鐵皮石斛莖多糖對羥基自由基（OH）的清除作用。用Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生羥基自由基（OH）。H2O2/Fe2+體系可通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生經(jīng)自由基，化學(xué)反應(yīng)如下:H2O2+Fe2+OH+OH+Fe3+用OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510nm處有強(qiáng)吸收峰，若體系中加入清除OH的物質(zhì)，則會減少有色物質(zhì)的生成，吸收度降低。吸光度越低，清除OH效果越好。測量過程：取2支試管并依次編號為1、2。兩支試管各加入9mmol/L的FeSO4 1ml，9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2.00ml，將1號試管加入鐵皮石斛多糖樣品溶液2.00m