草本膠囊CDV-PRO體內(nèi)外抗菌作用的研究.doc

草本膠囊CDVPRO體內(nèi)外抗菌作用的研究劉啟（香港啟正寵物獸醫(yī)中心）CDV-PRO草本膠囊系德國alfavet公司於2004年開發(fā)的純天然草本藥劑（herbal medicine）.其主要成份以HoneySuchle Blumen Extract，F(xiàn)orsythia Extract、Echinacea purp Extract、Mentha piperita Extract、Achillea millefolium Extract為主，以傳統(tǒng)中國醫(yī)學(xué)理論結(jié)合西歐藥物提純技術(shù)。具有抵抗炎癥，退熱，改善呼吸道癥狀，增強免疫機能的作用（anti-infection, reduce fever, improvement of respiratory symptoms Strengthening the immune system）。2008年本中心引進該藥物，使用至今，用於犬貓病毒性呼吸器疾病(caninfeline viral respiratory diseases)的醫(yī)治，效果較為理想。為驗證cdv-pro膠囊對犬貓幾種呼吸器感染常見可分離之病原體的抑制效果，通過幾種呼吸器疾病常見致病細(xì)菌包括（Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes）的分離鑒定以及對分離菌株進行體內(nèi)外抗病原體作用的研究，為犬貓常見致病微生物引起的呼吸器疾病的治療和預(yù)防提供科學(xué)的理論依據(jù)。1 材料與方法11材料1.1.1 致病微生物 從本醫(yī)療中心幾間分店就診之患寵呼吸器採取的樣本，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)觀察，生化試驗、以及小白鼠致死性試驗等鑑定上述微生物體為呼吸器致病性病原體。1.1.2 試驗動物 健康atc種小白鼠，體重1820g。由TGH醫(yī)療科技公司提供。1.1.3 藥物 CDVPRO膠囊，由VETSHINE醫(yī)療貿(mào)易行提供。藥劑規(guī)格為200mg/cap。將膠囊拆開後，溶解於5ml滅菌蒸餾水中。1.2 方法1.2.1 體外抑制微生物試驗 KB紙片擴散法：將含不同濃度CDVPRO的滅菌紙片（直徑6mm）平置於已均勻涂布好Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes的平板表面，同時以生理鹽水紙片為陰性對照，置37培養(yǎng)24h後取出，測量各紙片周圍抑菌圈直徑。 瓊脂二倍稀釋法：藥液按無菌法依次稀釋至2，4，8，16倍，即濃度分別為0.5，0.25，0.125，0.63，即濃度分別為0.02，0.01，0.005，0.0025g/ml.將已稀釋藥液與普通瓊脂培養(yǎng)基充分混勻，制成含藥物的平板培養(yǎng)基。用接種環(huán)取1：1000的Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes等五種懸液，畫線接種於上述含藥平板培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌的生長情況，細(xì)菌不生長的最低濃度即為該藥物對該菌的最小抑菌濃度（MIC值）。1.2.2 體內(nèi)抗菌試驗 動物分組及用藥：健康atc種小白鼠250只，雌雄隨機，隨機分為5組，每組10只，CDVPRO設(shè)高，低劑量組，劑量分別為15，5G、kg，陽性對照組為amp組，同時設(shè)正常對照組和感染對照組。經(jīng)預(yù)試測得感染小白鼠死亡的最小致死量，並作為感染菌量。結(jié)果使小白鼠死亡率達到90%的Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes濃度分別是3X 105，6X 107，3X 108，6X 107，6X 105，劑量是0.5ml/只。連續(xù)灌胃給藥7D，每天1次，於給藥第4天皮下注射（sc inject）上述Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes菌液（0.5ml/只）感染小白鼠，再連續(xù)給藥3D，統(tǒng)計每組小白鼠死亡數(shù)。2 結(jié)果2.1 體外抑菌作用2.1.1KB紙片擴散法的試驗結(jié)果 結(jié)果見表1表1.1 各紙片周圍的抑菌圈直徑（Bordetella bronchiseptica）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.507.340.348.320.6514.210.775.310.54表1.2各紙片周圍的抑菌圈直徑（Pseudomonas aeruginosa）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.506.330.359.720.7613.210.988.340.67表1.3各紙片周圍的抑菌圈直徑（Klebsiella）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.507.340.657.670.559.210.375.310.55表1.4各紙片周圍的抑菌圈直徑（Staphylococcus aureus）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.506.340.948.320.8912.210.775.310.34表1.5各紙片周圍的抑菌圈直徑（Streptococcus pyogenes）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.507.780.358.320.6513.280.877.340.74由表1各表可知，CDVPRO在0.25，0.5，1.0g/ml濃度時，對Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes均有明顯抵制作用。隨著CDVPRO濃度的增強，抑菌作用更顯著。抑菌效果均好於amp組。2.1.2 瓊脂二倍稀釋法的試驗結(jié)果 在0.0025g/ml的CDV-PRO平皿中可以看到有細(xì)菌散在生長，而在0.02，0.01，0.005g/ml的CDVPRO平皿中無細(xì)菌生長。因此確定CDVPRO對Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes的MIC值為0.005g/ml.2.2 體內(nèi)抗菌作用結(jié)果見表2表2.1 CDVPRO對Bordetella bronchiseptica感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數(shù)/只死亡數(shù)/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組155510101010100901409001040101009060表2.2 CDVPRO對Pseudomonas aeruginosa感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數(shù)/只死亡數(shù)/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組155510101010100902509002050101008050表2.3 CDVPRO對Klebsiella感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數(shù)/只死亡數(shù)/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組155510101010100901509001050101009050表2.4 CDVPRO對Staphylococcus aureus感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數(shù)/只死亡數(shù)/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組15551010101010091360901306010907040表2.5 CDVPRO對Streptococcus pyogenes感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數(shù)/只死亡數(shù)/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組15551010101010091230901203010908070由表2.12.5可知，CDVPRO高，低劑量組可明顯降低小白鼠受Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes感染後的死亡率，對致病性Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes感染的小白鼠有顯著的保護作用。3 小結(jié)與討論 體外抑菌試驗結(jié)果表明，CDVPRO對犬貓致病性呼吸器的Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes具有較強抵制作用，抑菌效果隨著藥液濃度的升高呈現(xiàn)高效性，瓊脂二倍稀釋法測得MIC值為0.005g/ml；由體內(nèi)抗菌試驗可見，CDVPRO可以明顯提高致病性Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes感染的小白鼠的存活率，有明顯保護作用。試驗從體外，體內(nèi)兩方面的抗菌作用驗證了CDVPRO具有良好的抗菌作用，具效果顯著，從而為該藥防治犬貓呼吸器疾病提供了一定的藥理學(xué)理論依據(jù)。 CDVPRO的主要成份為HoneySuchle Blumen Extract，F(xiàn)orsythia Extract、Echinacea purp Extract、Mentha piperita Extract、Achillea millefolium Extract因為受儀器設(shè)備的制限，無法做病毒方面的研究，但CDVPRO中各成份起協(xié)同作用以及對機會具有免疫作用有關(guān)，希望在以後的做進一步的研究。四、參考文獻1，狗的疾病認(rèn)識Part-3-6 犬瘟熱 巖元照男 著 大坤書局 19922，犬的病氣預(yù)防手冊 Part-3傳染病 練馬小動物研究會 著 金園社 19973，金絲桃素對禽流感H5N1和H9N2亞型病毒的殺滅效果 梁劍平20054，The invasive shrub, Lonicera maackii, reduces growth and fecundity of perennial forest herbs Miller KE (Gorchov DL, Miami Univ, Dept Bot, Oxford, OH 45056, USA) ； Gorchov DL Oecologia 2004 年139卷3期5，Regeneration of Lonicera tatarica plants via adventitious organogenesis from cultured stem explants Palacios N (Leech MJ, John Innes Ctr Plant Sci Res, Mol Biotechnol Unit, Norwich Res Pk, Norwich NR4 7UH, Norfolk, England) ； Christou P Leech MJ Plant Cell Reports 2002 年20卷9期 6，The relative importance of landscape and community features in the invasion of an exotic shrub in a fragmented landscape Bartuszevige, AM (Miami Univ, Dept Bot, Oxford, OH 45056 USA) ； Gorchov, DL Raab, L Ecography 2006 年29卷2期 7，Entamoeba histolytica modulates a complex repertoire of novel genes in response to oxidative and nitrosative stresses: implications for amebic pathogenesis Vicente, JB (Vicente, JB) ； Ehrenkaufer, GM (Ehrenkaufer, GM) ； Saraiva, LM (Singh, U Stanford Univ, Sch Med, Dept Microbiol &) ； Teixeira, M (Immunol, Stanford, CA 94305 USA) ； Singh, U (Vicente, JB) Cellular microbiology 2009 年11卷1期 8，Echinacea tennesseensis ethanol tinctures harbor cytokine- and proliferation-enhancing capacities Senchina DS (Biology Department, Drake University, 2507 University Ave., Des Moines, IA 50311, USA.) ； McCann DA (Biology Department, Drake University, 2507 University Ave., Des Moines, IA 50311, USA.) ； Flinn GN (Biology Department, Drake University, 2507 University Ave., Des Moines, IA 50311, USA.) ； Wu L (Biology Department, Drake University, 2507 University Ave., Des Moine