食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).doc

食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)1 食品中細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定1 目的要求（1）掌握食品中菌落總數(shù)測(cè)定方法。（2）了解食品清潔程度（被污染程度）及觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，從而為被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。2 基本原理菌落（colony）是指細(xì)菌在某一種固體培養(yǎng)基上克隆增殖發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)。菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)成分，培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等），所得1mL（g，cm2)檢樣中所含菌落總數(shù)。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colony forning unit。菌落總數(shù)是作為判定食品的清潔程度（被污染程度）的標(biāo)記，通常越干凈的食品，單位樣品菌落總數(shù)越低。反之，菌落總數(shù)就越高。菌落總數(shù)的測(cè)定是以每個(gè)活細(xì)菌能克隆增殖形成一個(gè)可見(jiàn)的單獨(dú)菌落為基礎(chǔ)的，但是在實(shí)踐中除了單個(gè)細(xì)胞形成菌落外，二個(gè)或兩個(gè)以上相連的同種細(xì)胞也同樣可形成菌落，所以現(xiàn)在均以菌落總數(shù)（而不是活細(xì)菌數(shù)）或菌落形成單位數(shù)表達(dá)。由于菌落總數(shù)的測(cè)定是在37有氧條件下培養(yǎng)的結(jié)果，對(duì)于厭氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜熱菌在此條件下不生長(zhǎng)，有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的細(xì)菌也受到限制。因此，這種方法所得到的結(jié)果，實(shí)際上只包括一群在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。但由于在自然界這類(lèi)細(xì)菌占大多數(shù)，其數(shù)量的多少能反映出樣品中細(xì)菌的總數(shù)，正因?yàn)槿绱?，用該方法?lái)測(cè)定食品中含有的細(xì)菌總數(shù)已得到了廣泛的認(rèn)可。3 實(shí)驗(yàn)材料31 儀器 恒溫箱、冰箱、恒溫水浴鍋、天平、微波爐、均質(zhì)器。32 材料 吸管（容量為0.1mL、1m和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、滅菌平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、滅菌鑷子。33 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、75%乙醇、0.85%生理鹽水。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟 41 菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)程序（如圖28-1）42 檢樣稀釋及培養(yǎng)（1）以無(wú)菌操作將檢樣25g(25mL)剪碎放于裝有225mL滅菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，經(jīng)過(guò)充分振蕩或均質(zhì)處理制作成1：10的均勻稀釋液（固體食品有的需先用滅菌研缽研磨后再稀釋?zhuān)?。?）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管混合均勻，作成1：100稀釋液，按上述操作順序，作10倍系列稀釋液，每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。（3）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋液，分別在作10倍遞增稀釋同時(shí)，吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。（4）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將融化并冷卻到46營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入加有無(wú)菌生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。（5）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36+1溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2hr（肉、乳和蛋品為48+2h，水產(chǎn)為3048+2h）。48+2h36+1檢樣做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇23個(gè)適宜稀釋度，各以1ml量加入滅菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入適量營(yíng)養(yǎng)瓊脂菌落計(jì)數(shù)結(jié)果圖28-1 菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)程序43 菌落計(jì)數(shù) 將培養(yǎng)24h后的平板取出，選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，取兩個(gè)平板的平均數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（或毫升）樣品所含菌落總數(shù)。44 平板菌落計(jì)數(shù)方法(1) 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30300個(gè)之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)，且一個(gè)稀釋度應(yīng)使用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中當(dāng)一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。(2) 稀釋度的選擇A應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。B若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30300個(gè)之間，則視二者之比如何來(lái)決定，若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若兩者之比大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字。C若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。D若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最底的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。E若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。F若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。(3) 菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在100以?xún)?nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來(lái)表示。(見(jiàn)表28-1)表28-1 稀釋度選擇及菌落數(shù)報(bào)告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（cfu/g，mL）報(bào)告方式（cfu/g，mL）10-110-210-31多不可計(jì)16420-16400016000或1.61042多不可計(jì)29546163775038000或3.81043多不可計(jì)27160222710027000或2.71044多不可計(jì)多不可計(jì)313-313000310000或3.1105527115-270270或2.71026000-110107多不可計(jì)30512-3050031000或3.11045 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）將實(shí)驗(yàn)得到的菌落總數(shù)結(jié)果記入下表10-210-310-410-5備注12平均（2）報(bào)告所選兩個(gè)稀釋度之比及檢測(cè)結(jié)果。6 注意事項(xiàng)（1）若實(shí)驗(yàn)樣品為食品，為防止食品碎屑混入瓊脂影響計(jì)數(shù)，通常需在瓊脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，每100mL加1mL0.5%TTC，培養(yǎng)后，如系食品顆粒，不見(jiàn)變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落。（2）理論上講，為了得到實(shí)驗(yàn)食品中所有細(xì)菌菌落總數(shù)，應(yīng)將樣品接種到幾種不同的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)在不同的條件下，所得到的細(xì)菌菌落數(shù)總和。但根據(jù)國(guó)家頒發(fā)的不同食品的規(guī)定，都是根據(jù)用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37（水產(chǎn)品30）進(jìn)行需氧培養(yǎng)的結(jié)果來(lái)確定的，而且這種測(cè)定確具代表性，因而菌落總數(shù)在一般衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)中并不要求用不同培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。（3）目前還有幾種快速檢測(cè)菌落總數(shù)的方法如由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制而成食品細(xì)菌檢驗(yàn)箱，菌落總數(shù)測(cè)定采用試管斜面計(jì)數(shù)法操作簡(jiǎn)便，不易受污染，結(jié)果與國(guó)標(biāo)法平板計(jì)數(shù)一致。另一種是3M有限公司提供的Petrifilm Plates測(cè)試片（菌落總數(shù)測(cè)試片）。由于測(cè)試片中含有一種紅色指示劑，使所有菌落易于識(shí)別計(jì)數(shù)，該片也可用于乳酸菌測(cè)定，48hr可確定菌落總數(shù)。7 思考題（1）什么是菌落總數(shù)，何謂cfu？（2）若平板上菌落數(shù)生長(zhǎng)一半較均勻，另一半呈片生長(zhǎng)，如何計(jì)數(shù)菌落數(shù)？（3）影響雜菌總數(shù)準(zhǔn)確性的因素有哪些？實(shí)驗(yàn)2 食品中大腸菌群的測(cè)定1 目的要求（1）學(xué)習(xí)與掌握食品中大腸菌群的測(cè)定方法。（2）了解大腸菌群在食品衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)中的意義。2 基本原理大腸菌群系指一群在3724hr能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的埃希氏無(wú)芽孢桿菌。它包括大腸埃希氏桿菌和檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌等類(lèi)大腸桿菌。大腸菌群的檢測(cè)就是根據(jù)大腸菌群的定義，即利用它們能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特性而設(shè)計(jì)的初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；初發(fā)酵陽(yáng)性管通過(guò)伊紅美蘭平板進(jìn)行分離；復(fù)發(fā)酵對(duì)分離菌作證實(shí)實(shí)驗(yàn)的三步法。根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的最可能數(shù)（食品中大腸菌群系以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN表示），MPN最可能數(shù)是表示樣品中活菌密度的估計(jì)。3 實(shí)驗(yàn)材料31 儀器 溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、微波爐、均質(zhì)器、普通光學(xué)顯微鏡。32 材料 吸管（0.1mL、1mL和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、鑷子、小倒管等。33 培養(yǎng)基 乳糖膽鹽培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，革蘭氏染色液，0.85%生理鹽水。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟41 大腸菌群檢驗(yàn)程序（如圖29-1）42 檢樣稀釋取檢樣25g(mL)剪碎，以225mL滅菌生理鹽水稀釋做成1:10稀釋液，并依次做10倍遞增稀釋液，例如10-1，10-2，10-3，10-4等，估計(jì)樣品污染程度，選擇3個(gè)合適稀釋液備用。43 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待稀釋檢樣品接種乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36+1溫箱內(nèi)培養(yǎng)24+2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，可報(bào)告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。44 分離培養(yǎng)用接種環(huán)挑取產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管劃線(xiàn)接種在伊紅美蘭瓊脂平板上，36+1溫箱內(nèi)1824h培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。典型的大腸埃希氏菌落呈紫黑色金屬光澤，非典型大腸菌群有時(shí)為紅色菌落。45 證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取帶有黑色金屬光澤的可疑大腸菌群菌落12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36+1培養(yǎng)24+2h后觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色陰性的無(wú)芽孢桿菌即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。檢樣稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管(36+1,24+2h)不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報(bào) 告產(chǎn) 氣伊紅美蘭瓊脂平板(36+1,24+2h) (24+2h,36+1)革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管(36+1,24+2h)革蘭氏染色陽(yáng)性革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報(bào) 告大腸桿菌陽(yáng)性報(bào) 告大腸菌群陰性報(bào) 告圖29-1 大腸菌群檢驗(yàn)程序5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）將大腸菌群檢驗(yàn)結(jié)果填入下表接種量管號(hào)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果有無(wú)典型菌落革蘭氏染色結(jié)果復(fù)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果最后結(jié)論+或-1mL1230.1mL1230.01mL123（2）根據(jù)證實(shí)為大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查（MPN檢索表后報(bào)告每100mL (g)大腸菌群的最可能數(shù)。6 注意事項(xiàng)雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖發(fā)酵管專(zhuān)供醬油及醬類(lèi)檢驗(yàn)用，3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實(shí)試驗(yàn)用。（1）初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)與證實(shí)實(shí)驗(yàn)有時(shí)不一定符合。凡初發(fā)酵的產(chǎn)氣管一定要做伊紅美蘭平板分離。如果平板出現(xiàn)典型的大腸菌菌落，G-染色陰性無(wú)芽孢菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落少，應(yīng)多挑取菌落包括挑菌落中心黑紅、灰紅，以及紅、粉紅等菌落，在革蘭氏染色的同時(shí)，做證實(shí)試驗(yàn)，以免出現(xiàn)假陰性。（2）關(guān)于產(chǎn)氣 發(fā)酵管內(nèi)的小倒管如儲(chǔ)留氣體則是陽(yáng)性結(jié)果，如果不存留氣體，但液面及管壁可以看到緩慢上浮的小氣泡，或者對(duì)沒(méi)有氣體產(chǎn)生的發(fā)酵管用手輕輕彈動(dòng)試管，有氣泡出現(xiàn)而且沿管壁上升，都應(yīng)考慮可能是由菌發(fā)酵產(chǎn)生氣體的緣故。應(yīng)做進(jìn)一步觀察，因?yàn)檫@種情況陽(yáng)性檢出率可達(dá)50%以上。（3）所謂典型大腸埃希氏菌是指具有該菌所有生物學(xué)特性的大腸菌。新近隨糞便排出的大腸菌多屬于這一類(lèi)型。所以如查出多量典型大腸埃希氏菌表明樣品是糞便的近期污染結(jié)果。研究表明，典型大腸菌隨糞便排到外界環(huán)境中約一周后，典型菌可變?yōu)榉堑湫途?。這種變化以生化變異為主。如果樣品檢測(cè)以非典型大腸菌為主，則指示樣品受糞便的遠(yuǎn)期污染。大腸埃希氏菌大量存在于人畜腸道，并隨糞便排出。本菌在糞便中數(shù)量多，易于培養(yǎng)，對(duì)外界的抵抗力與腸道致病菌比較相近，所以選擇大腸埃希氏菌作為被糞便污染的指示菌，合理、科學(xué)。凡被糞便污染的樣品，就有可能受到致病菌污染。所以大腸菌群的測(cè)定是必做的食品衛(wèi)生學(xué)檢項(xiàng)目。（4）大腸菌群檢驗(yàn)方法（國(guó)標(biāo)）采用的管發(fā)酵通常需三天，目前已開(kāi)發(fā)出幾種快速檢驗(yàn)方法（TTC顯色法，DC試管法，紙片法）。如由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院研制而成的一小時(shí)快速檢測(cè)法，檢驗(yàn)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法一致。3M中國(guó)有限公司提供的petrifilm plates測(cè)試片，可在小時(shí)確定大腸菌群數(shù)。7 思考題（1）什么是大腸菌群？大腸菌群表示的單位及其意義。（2）固體檢樣三個(gè)稀釋度檢測(cè)結(jié)果都是陰性時(shí)，MPN怎樣表示？（3）液體檢樣三個(gè)稀釋度檢測(cè)結(jié)果都是陰性時(shí)，MPN怎樣表示？（4）大腸菌群檢驗(yàn)中為什么首先要用乳糖膽鹽發(fā)酵管發(fā)酵？實(shí)驗(yàn)3 食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)1 目的要求（1）了解食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法。（2）觀察金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板和Baird-Parker氏瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落特征。（3）觀察金黃色葡萄球菌產(chǎn)生血漿凝固酶現(xiàn)象。2 基本原理金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種毒素和酶。在血平板上生長(zhǎng)時(shí)，因產(chǎn)生金黃色色素使菌落呈金黃色；由于產(chǎn)生溶血素使菌落周?chē)纬纱蠖该鞯娜苎?。在Baird-Parker氏平板上生長(zhǎng)時(shí)，因?qū)嗧谒徕涍€原成碲酸鉀使菌落呈灰黑色；因產(chǎn)生脂酶使菌落周?chē)幸粶啙釒В谄渫鈱右虍a(chǎn)生蛋白水解酶有一透明帶。在肉湯中生長(zhǎng)時(shí)，菌體可生成血漿凝固酶并釋放于培養(yǎng)基中（叫做游離凝固酶）。此酶類(lèi)似凝血酶原物質(zhì)，不直接作用到血漿纖維蛋白原上，而是被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變成固態(tài)纖維蛋白，血漿因而成凝固狀態(tài)。3 實(shí)驗(yàn)材料31儀器和材料 顯微鏡、溫箱、離心機(jī)、滅菌吸管（1mL，10mL）、滅菌試管、滅菌平皿、均質(zhì)器、載玻片、L型涂布棒、酒精燈、接種環(huán)。32 培養(yǎng)基及試劑 胰酪胨大豆肉湯、7.5%氯化鈉肉湯、豆粉瓊脂、血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、肉浸液肉湯、兔血漿、革蘭氏染色液等。4實(shí)驗(yàn)方法與步驟41 金黃色葡萄球菌檢測(cè)程序（如圖30-1）24h36+124h36+124h36+124h36+1檢樣25g(ml)+225ml滅菌生理鹽水直接記數(shù)方法增菌培養(yǎng)方法Baird-Parker平板0.3ml、0.3ml、0.4ml7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯血 平 板血平板，Baird-Parker平板涂片染色觀察溶血血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)報(bào) 告圖30-1 金黃色葡萄球菌檢測(cè)程序42 增菌培養(yǎng)法（1）檢樣處理稱(chēng)取25g固體樣品或吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。（2）增菌及分離培養(yǎng)吸取5mL上述混懸液，接種于50mL7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置361溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種于血平板和BairdParker平板上，361培養(yǎng)24h，挑取可疑金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。（3）形態(tài)金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列是葡萄球狀，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.51m。（4）培養(yǎng)特征在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)，血平板上菌落呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周?chē)腥苎ΑＴ贐airdParker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周?chē)鸀橐换鞚釒?，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類(lèi)似菌落，但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。（5）血漿凝固酶試驗(yàn)吸取14新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，放361溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。43 直接計(jì)數(shù)法（1）吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)鶕?jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入到三塊BairdParker平板中，每個(gè)平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個(gè)平板。如水分不多吸收，可將平板放在361溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置361溫箱培養(yǎng)。（2）在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周?chē)谢鞚釒У暮谏?，并從中任選5個(gè)菌落，分別接種血平板，36124h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。（3）將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌的黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）金黃色葡萄球菌涂片染色鏡檢為陽(yáng)性球菌，致病性葡萄球菌一般較非致病性葡萄球菌小，且各個(gè)菌體的大小排列也較整齊。細(xì)菌繁殖時(shí)呈多個(gè)平面的不規(guī)則分裂，堆積成葡萄串狀。在中毒食品、膿汁或液體培養(yǎng)基中常呈單個(gè)或環(huán)球短鏈排列，易誤認(rèn)為鏈球菌或細(xì)球菌。（2）金黃色葡萄球菌在血平板上菌落呈金黃色，周?chē)腥苎?，在Baird-Parker平板上菌落呈灰黑色，周?chē)鸀橐粶啙釒В谄渫鈱佑幸煌该魅?。?）致病性葡萄球菌血漿凝固酶為陽(yáng)性。6 注意事項(xiàng)（1）在做樣品中金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)進(jìn)行10倍遞次稀釋時(shí)，要注意每個(gè)稀釋度更換吸管。（2）實(shí)驗(yàn)中操作者須注意生物安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實(shí)驗(yàn)材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。7 思考題（1）金黃色葡萄球菌引起食物中毒的機(jī)理是什么？（2）為什么采用血漿凝固酶試驗(yàn)來(lái)決定葡萄球菌致病和不致病?實(shí)驗(yàn)4 食品中溶血性鏈球菌的檢測(cè)1 目的要求（1）了解食品和食物中毒樣品中溶血性鏈球菌的檢測(cè)方法。（2）觀察溶血性鏈球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板上菌落特征及溶血情況。（3）觀察乙型溶血性鏈球菌產(chǎn)生鏈激酶的現(xiàn)象以及桿菌肽敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2 基本原理乙型（）溶血性鏈球菌致病性強(qiáng)，能產(chǎn)生溶血毒素，在血平板上生長(zhǎng)，可使菌落周?chē)纬梢粋€(gè)有24mm寬，界限分明，完全透明的無(wú)色溶血環(huán)，稱(chēng)乙型溶血；還能產(chǎn)生鏈激酶（又稱(chēng)溶纖維蛋白酶），激活血漿中的血漿蛋白酶原，使之變成活動(dòng)性的血漿蛋白酶，故可溶解血塊或阻止血漿凝固；還可以產(chǎn)生胞外cAMP因子，它可以增強(qiáng)葡萄球菌的溶血能力，即增強(qiáng)對(duì)羊、牛血紅細(xì)胞的溶解能力。因此，在羊血瓊脂平板上接種鏈球菌處，可以見(jiàn)到蘑菇狀或箭頭樣的溶血區(qū)。3 實(shí)驗(yàn)材料31設(shè)備和材料 溫箱、水浴、顯微鏡、離心機(jī)、試管架、滅菌平皿、滅菌小試管、載玻片、滅菌吸管（1mL、10mL）滅菌鑷子、均質(zhì)器、酒精燈、接種環(huán)。32培養(yǎng)基和試劑 葡萄糖肉浸液肉湯、牛心浸液、匹克氏肉湯、血瓊脂平板、人血漿、0.25%氯化鈣、滅菌生理鹽水、桿菌肽藥敏紙片(含0.04單位)。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟：41溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序（如圖31-1）36檢樣25g（ml）225ml滅菌生理鹽水葡萄糖肉侵液肉湯或匹克氏肉湯血平板3624h血干板（分純培養(yǎng)）3624h24h鏈激酶試驗(yàn)桿菌肽敏感試驗(yàn)觀察溶血革蘭氏染色報(bào) 告圖31-1 溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序42 樣品處理稱(chēng)取25g固體檢樣或稱(chēng)取25mL液體檢樣，加入225mL滅菌生理鹽水制成混懸液。43 一般培養(yǎng)將上述混懸液吸取5mL，接種于50mL葡萄糖肉浸液肉湯或直接劃線(xiàn)接種于血平板，如檢樣污染嚴(yán)重，可同時(shí)按上述量接種匹克氏肉湯，經(jīng)361培養(yǎng)24h后接種血平板，置361培養(yǎng)24h，挑取乙型溶血圓形突起的細(xì)小菌落在血平板上分純，然后觀察溶血情況及革蘭氏染色，并進(jìn)行鏈激酶試驗(yàn)及桿菌肽敏感試驗(yàn)。44 形態(tài)與染色本菌呈球形或卵圓形，直徑0.51m，鏈狀排列，鏈長(zhǎng)短不一，短者48個(gè)細(xì)胞組成，長(zhǎng)者2030個(gè)，鏈的長(zhǎng)短常與細(xì)菌的種類(lèi)及生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)；液體培養(yǎng)中易呈長(zhǎng)鏈；在固體培養(yǎng)基中常呈短鏈，不形成芽孢，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。45 培養(yǎng)特性該菌營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良，在加有血液、血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好。溶血性鏈球菌在血清肉湯中生長(zhǎng)時(shí)，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀。血平板上菌落為灰白色，半透明或不透明，表面光滑有乳光，直徑約0.50.75m，為圓形突起的細(xì)小菌落，乙型溶血鏈球菌周?chē)?4mm界限分明、無(wú)色透明的溶血圈。46 鏈激酶試驗(yàn)致病性乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶(即溶纖維蛋白酶)，此酶能激活正常人體血液中的血漿蛋白酶原成為血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。吸取草酸鉀血漿0.2mL，加0.8mL滅菌生理鹽水混勻，再加入1824h 361培養(yǎng)的鏈球菌培養(yǎng)物0.5mL及0.25%氯化鈣0.25mL(如氯化鈣已潮解，可適當(dāng)加大至0.3%0.35%)，振蕩搖勻，置于361水浴中10min，血漿混合物自行凝固 (凝固程度至試管倒置，內(nèi)容物不流動(dòng))。然后觀察凝固塊重新完全溶解的時(shí)間，完全溶解為陽(yáng)性。若24h后不溶解即為陰性。草酸鉀人血漿配制：草酸鉀0.01g放入滅菌小試管中，再加入5mL人血混勻，經(jīng)離心沉淀吸取上清液即為草酸鉀人血漿。47 桿菌肽敏感試驗(yàn)挑取乙型溶血性鏈球菌液涂布于血平板上，用滅菌鑷子夾取每片含有0.04單位的桿菌肽紙片放于上述平板上，置于361下培養(yǎng)1824h，如有抑菌帶出現(xiàn)即為陽(yáng)性。同時(shí)用已知陽(yáng)性菌株作為對(duì)照。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）溶血性鏈球菌涂片染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性，呈球形或卵原形直徑為0.51微米，鏈狀排列，鏈的長(zhǎng)短不一，短者由48個(gè)菌體組成，長(zhǎng)者達(dá)2030個(gè)菌。液體培養(yǎng)基中易呈長(zhǎng)鏈，固體培養(yǎng)基中常呈短鏈。（2）溶血性鏈球菌在血平板上形成的菌落為灰白色，半透明，表面光滑有乳光，直徑約為0.50.75mm的圓形突起的細(xì)小菌落。乙型溶血性鏈球菌菌落周?chē)释耆苎?，并有明顯的溶血境界。在顯微鏡低倍鏡下觀察，菌落周?chē)话悴荒芤?jiàn)到紅血球。乙類(lèi)溶血性鏈球菌在血平板上對(duì)桿菌胎敏感，經(jīng)37培養(yǎng)18小時(shí)，出現(xiàn)明顯抑菌圈。6 注意事項(xiàng)（1）做鏈激酶實(shí)驗(yàn)時(shí)注意人血漿應(yīng)新鮮。（2）實(shí)驗(yàn)中操作者須注意生物安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要消毒環(huán)境，把實(shí)驗(yàn)材料高壓滅菌后方可清洗或棄之。7 思考題（1）溶血性鏈球菌在血平板上生長(zhǎng)時(shí)的菌落特征？（2）溶血性鏈球菌的致病力強(qiáng)弱與那些生物特性有關(guān)？實(shí)驗(yàn)5 食品中沙門(mén)氏菌屬的檢驗(yàn)1目的要求（1）學(xué)習(xí)食品中沙門(mén)氏菌屬的檢驗(yàn)方法和基本原理。（2）熟悉沙門(mén)氏菌屬因子血清的使用方法。（3）了解沙門(mén)氏菌屬的生化反應(yīng)及基本原理。2 基本原理沙門(mén)氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類(lèi)和動(dòng)物發(fā)病及食物中毒的主要病原菌之一。食品中沙門(mén)氏菌的含量較少，且常由于食品加工過(guò)程使其受到損傷而處于瀕死的狀態(tài)。為了分離與檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌，對(duì)某些加工食品必須經(jīng)過(guò)前增菌處理，用無(wú)選擇性的培養(yǎng)基使處于頻死狀態(tài)的沙門(mén)氏菌恢復(fù)其活力，再進(jìn)行選擇性增菌，使沙門(mén)氏菌得以增殖而大多數(shù)的其它細(xì)菌受到抑制，然后再進(jìn)行分離鑒定。沙門(mén)氏菌屬是一群血清學(xué)上相關(guān)的需氧，無(wú)芽孢的革蘭氏陰性桿菌，周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、乳糖及蔗糖，不液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不分解尿素，能有規(guī)律地發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)生氣體。沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌由于不發(fā)酵乳糖，能在各種選擇性培養(yǎng)基上生成特殊形態(tài)的菌落。大腸桿菌由于發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而出現(xiàn)與沙門(mén)氏菌形態(tài)特征不同的菌落，如在SS瓊脂平板上使中性紅指示劑變紅，菌落呈紅色，借此可把沙門(mén)氏菌同大腸桿菌相區(qū)別。根據(jù)沙門(mén)氏菌屬的生化特征，借助于三糖鐵、靛基質(zhì)，尿素、KCN，賴(lài)氨酸等試驗(yàn)可與腸道其它菌屬相鑒別。本菌屬的所有菌種均有特殊的抗原結(jié)構(gòu)，借此也可以把它們分辨出來(lái)。3 實(shí)驗(yàn)材料31設(shè)備和材料 天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌三角燒瓶、滅菌吸管（l0mL）、滅菌平皿、滅菌小玻管、滅菌毛細(xì)吸管、橡皮乳頭、載玻片、酒精燈、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架等。32 培養(yǎng)基和試劑 緩沖蛋白胨水(BP)，氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液，四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，亞硫酸鉍瓊脂(BS)，DHL瓊脂，HE瓊脂，SS瓊脂，三鐵糖瓊脂(TSI)，蛋白胨水，靛基質(zhì)試劑，pH7.2尿素瓊脂，KCN培養(yǎng)基，氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，糖發(fā)酵管，ONPG培養(yǎng)基，半固體瓊脂，緩沖葡萄糖蛋白胨水(附MR、VP試劑)，丙二酸鈉培養(yǎng)基，氧化酶試劑，革蘭氏染色液，26種(初步分型)、57種(一般分型)、144種(詳細(xì)分型)沙門(mén)氏菌因子血清。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟41 沙門(mén)氏菌屬檢驗(yàn)程序（如圖32-1）42 前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品均應(yīng)經(jīng)過(guò)前增菌。各稱(chēng)取樣品25g，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶?jī)?nèi)，固體食品可用均質(zhì)器，800010000rpm/min打碎lmin，或用研缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化。于361培養(yǎng)4h(干蛋品需培養(yǎng)1824h)，移取10mL轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42培養(yǎng)1824h。同時(shí)另取10mL，加入于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36l培養(yǎng)1824h。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過(guò)前增菌。各取25mL加入滅菌生理鹽水225mL，按前法做成檢樣勻液，取其半量接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)于42培養(yǎng)24h，另半量接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36l，培養(yǎng)1824h。43 分離取增菌液一環(huán)，劃線(xiàn)接種于BS平板一個(gè)和DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、或SS瓊脂平板)一個(gè)。于361分別培養(yǎng)1824h(DHL、HE，SS)或4048h(BS)。觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，沙門(mén)氏菌亞屬I(mǎi)、，、V和亞屬在各個(gè)平板上的菌落特征見(jiàn)表321。一般4h，干蛋品1824h361824h4048h361824h1824h3611824h3611824h424236檢 樣前增菌法：凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品 25gBP 225ml直接增菌法：鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品25g滅菌生理鹽水225ml，做成檢液勻液10mlMM(或TTB)100ml10ml+SC100ml;檢樣勻液25ml+MM（或TTB）100mlBSDHL(或HE、WS、SS)挑取可疑菌落TSI（斜面、底面、產(chǎn)氣、H2S），蛋白胨水（靛基質(zhì)），尿素（pH7.2），KCN，賴(lài)氨酸H2S+，靛基質(zhì) 尿素，KCN賴(lài)氨酸H2S+，靛基質(zhì) 尿素，KCN賴(lài)氨酸H2S，靛基質(zhì) 尿素，KCN賴(lài)氨酸/非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果甘露醇、山梨醇沙門(mén)氏菌血清學(xué)試驗(yàn)ONPG非沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌血清學(xué)試驗(yàn)非沙門(mén)氏菌報(bào) 告檢樣勻25mlSC100ml（或TTB）100ml圖32-1 沙門(mén)氏菌屬檢驗(yàn)程序表32-1 沙門(mén)氏菌屬各亞屬在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板亞屬、亞屬（即亞利桑那菌）亞硫酸 瓊脂產(chǎn)H2S菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色、菌落周?chē)囵B(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生H2S，形成灰綠色的菌落，周?chē)囵B(yǎng)基不變色。黑色有金屬光澤。DHL瓊脂無(wú)色半透明，產(chǎn)生H2S菌落中心帶黑色或幾乎全黑色。乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株，與亞屬、相同，乳糖陽(yáng)性的菌株為粉紅色，中心帶黑色。HE瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌株產(chǎn)H2S，菌落中心黑色或幾乎全黑色。乳糖陽(yáng)性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中心黑色或幾乎全黑色。SS瓊脂無(wú)色透明，產(chǎn)生H2S菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯。乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株，與亞屬、相同；乳糖陽(yáng)性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無(wú)黑色形成時(shí)與大腸埃希氏菌不能區(qū)別。44三糖鐵高層瓊脂初步鑒別挑選上述選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種到三糖鐵瓊脂斜面試管中，于361分別培養(yǎng)1824h，然后根據(jù)表32-2初步判斷是否為可疑沙門(mén)氏菌。表32-2 腸桿菌科各菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣H2S可能的菌屬/沙門(mén)氏菌屬、變形桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、愛(ài)德華氏菌屬/沙門(mén)氏菌屬亞屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬沙門(mén)氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬傷寒沙門(mén)氏菌、雞沙門(mén)氏菌、志賀氏菌屬、埃希氏菌屬、哈夫尼亞菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬/埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬該表說(shuō)明在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸并同時(shí)H2S陰性的菌株可以排除，其它的反應(yīng)結(jié)果均有沙門(mén)氏菌的可能，同時(shí)也均有不是沙門(mén)氏菌的可能。因此需要做幾項(xiàng)最低限度的實(shí)驗(yàn)。45生化試驗(yàn)在接種三糖鐵的同時(shí)，再接種蛋白胨水(供作靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素（pH7.2）瓊脂、KCN培養(yǎng)基和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基各一管，于36l培養(yǎng)18-24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)，按表32-3判斷結(jié)果。按反應(yīng)序號(hào)分類(lèi)，沙門(mén)氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于A1、A2和B1，其它五種結(jié)果均可排除。表32-3 腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào)H2S靛基質(zhì)pH7.2尿素KCN賴(lài)氨酸脫羧酶判定菌屬A1沙門(mén)氏菌屬A2沙門(mén)氏菌屬（少見(jiàn)）、愛(ài)德華氏菌屬A3枸櫞酸桿菌屬、奇異變形桿菌A4普通變形桿菌B1沙門(mén)氏菌屬、埃希氏菌屬甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬B2埃希氏菌屬埃希氏菌屬、志賀氏菌屬B3/克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、枸櫞酸桿菌屬B4/摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬注：（1）三糖鐵瓊脂底層均應(yīng)產(chǎn)酸，不產(chǎn)酸者可排除。斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。（2）KCN和賴(lài)氨酸可選用其中一項(xiàng)，但不能判定結(jié)果，仍需補(bǔ)做另一項(xiàng)。（3）陽(yáng)性、陰性、/多數(shù)陽(yáng)性、少數(shù)陰性。（1）反應(yīng)序號(hào)A1典型反應(yīng)判定為沙門(mén)氏菌屬。如尿素、KCN和賴(lài)氨酸三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常、按表323附1仍可判定為沙門(mén)氏菌。如有兩項(xiàng)異常，則按A3，判定為枸櫞酸桿菌。表32-3-A 附1pH7.2 尿素KCN賴(lài)氨酸判 定 結(jié) 果甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）沙門(mén)氏菌 或 （要求符合本群生化特性）沙門(mén)氏菌個(gè)別變種（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）（2）反應(yīng)序號(hào)A2可先做血清學(xué)鑒定，當(dāng)AF多價(jià)血清不凝集時(shí)，補(bǔ)作甘露醇和山梨醇，按表323附2判定結(jié)果。表32-3 附2甘露醇山梨醇判 定 結(jié) 果沙門(mén)氏菌屬靛基質(zhì)陽(yáng)性變種（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）緩慢愛(ài)德華氏菌（3）反應(yīng)序號(hào)B1三糖鐵斜面產(chǎn)酸的菌株可首先排除，不產(chǎn)酸者可先做血清學(xué)鑒定，當(dāng)AF多價(jià)血清不凝集時(shí)，補(bǔ)做鳥(niǎo)氨酸、ONPG、水楊苷、棉子糖和半固體動(dòng)力試驗(yàn)，按實(shí)驗(yàn)表323附3判定結(jié)果。必要時(shí)按表324，進(jìn)行沙門(mén)氏菌屬亞屬或其它亞屬的鑒定.表32-3 附3賴(lài)氨酸烏氨酸ONPG水楊苷棉子糖動(dòng)力判定結(jié)果沙門(mén)氏菌屬志賀氏菌屬宋內(nèi)氏志賀氏菌屬ddddd埃希氏菌屬注：判定結(jié)果時(shí)應(yīng)注意傷寒沙門(mén)氏菌鳥(niǎo)氨酸陰性，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌賴(lài)氯酸陰性，雞沙門(mén)氏菌無(wú)動(dòng)力。表中d表示有不同反應(yīng)結(jié)果。如果未做KCN試驗(yàn)時(shí)，常需做V-P試驗(yàn)（22250C，4天），哈夫尼亞菌屬為陽(yáng)性。表32-4 沙門(mén)氏菌屬亞屬的鑒定項(xiàng)目亞 屬乳糖/（）ONPG衛(wèi)矛醇丙二酸鈉KCN水楊苷（）遲緩陽(yáng)性46血清學(xué)分型鑒定（1）抗原的準(zhǔn)備一般采用1.5瓊脂斜面培養(yǎng)物作玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。O血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的(如253)培養(yǎng)基上再檢查，如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于lmL生理鹽水中作成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接種在0.70.8半固體瓊脂平板的中央，待菌落蔓延生長(zhǎng)后，在其邊緣部分取菌檢查，或?qū)⒕晖ㄟ^(guò)裝有0.30.4半固體瓊脂的小玻管12次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。（2）抗原的鑒定用AF多價(jià)O血清作玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)用生理鹽水作對(duì)照。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株，不能分型。被AF多價(jià)O血清凝集者，依次用O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2、和O11因子血清作凝集試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19單因子血清作凝集試驗(yàn)，判定E1、E2、E3、E4各亞群，每一個(gè)O抗原成份的最后確定均應(yīng)根據(jù)O單因子血清的檢查結(jié)果，沒(méi)有O單因子血清的要用兩個(gè)O復(fù)合因子血清進(jìn)行核對(duì)。 不被AF多價(jià)O血清凝集者，先用57種或144種沙門(mén)氏菌因子血清中的7種多價(jià)O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價(jià)O血清所包括的O因子如下：OA l，2，3，4，5，9，10，12，19，2l，26,46OB 6，7，8，11，13，14,20，22，23，24OC 16，17，18，28，30，35，38OD 39，40，41，42，43，44，45OE 47，48，50，51，52OF 53，54，55，56，57，58，59OG 60，61，62，63，65,66，67（3）H抗原的鑒定屬于AF各O群的常見(jiàn)菌型，依次用下述(表32一5)H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。不常見(jiàn)的菌型，先用144種沙門(mén)氏菌因子血清中的6種多價(jià)H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查以確定第1相或第2相的H抗原。每一個(gè)H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒(méi)有H單因子血清的要用兩個(gè)H復(fù)合因子血清進(jìn)行核對(duì)。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種12代后再檢查。如仍只檢出一個(gè)相應(yīng)的抗原，要用位相變異的方法檢驗(yàn)其另一個(gè)相。單菌相不必作位相變異檢查。表32-5 AF群見(jiàn)菌型H抗原表O群第1相第2相Aa無(wú)g,f,s無(wú)i,b,d2C1k,v, r ,c5 Z15C2b, d, r2，5D(不產(chǎn)氣的)d無(wú)D(不氣的)g m p q無(wú)E1h v6，w，xE2h6wE4g s t無(wú)E4iZ6Fi2HA a，b，c，d，i，Z10，Z29HB e，h；e，n，x；f，g；g，m，s；g，p；m，tHC k，l，v；r，y，Z，Z4，Z23HD 1，2；l，5；1，6；1，7；Z6HE Z35，Z36，Z38，Z39，Z41，Z42，Z44HF Z52，Z53，Z54，Z55，Z56，Z57（4）V1抗原的鑒定用V1因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有傷寒沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、都柏林沙門(mén)氏菌。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合以上生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果，按照考夫曼懷特沙門(mén)氏菌屬抗原表解和補(bǔ)充表解判定菌型，并報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6 思考題（1）如何提高沙門(mén)氏菌的檢出率？（2）沙門(mén)氏菌在三糖鐵培養(yǎng)基上的反應(yīng)結(jié)果如何？（3）沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)主要包括哪幾個(gè)主要步驟？實(shí)驗(yàn)6 食品中志賀氏菌屬的檢驗(yàn)1 目的要求（1）了解志賀氏菌的形態(tài)、培養(yǎng)以及生化反應(yīng)等特性。（2）學(xué)習(xí)志賀氏屬菌檢驗(yàn)的基本原理和方法。2 基本原理志賀氏菌屬為埃希氏桿菌，包括痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌四群，是引起人類(lèi)細(xì)菌性痢疾的病原菌。它們主要通過(guò)食品加工、集體食堂和飲食行業(yè)的從業(yè)人員中痢疾患者或帶菌者污染食物，從而導(dǎo)致痢疾的發(fā)生，是一種較常見(jiàn)的、危害較大的致病菌。志賀氏菌的鑒定主要根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)，再以生化反應(yīng)證實(shí)。3 實(shí)驗(yàn)材料31樣品：肉與肉制品、蛋與蛋制品、乳與乳制品等。32 設(shè)備和材料天平、均質(zhì)器或研缽、培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌廣口瓶、滅菌平皿、酒精燈、載玻片、滅菌金屬匙或玻璃棒、接種棒、試管架。33 培養(yǎng)基和試劑GN增菌液、HE瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、三糖鐵瓊脂、半固體瓊脂、賴(lài)氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、苯丙氨酸瓊脂、西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂、葡萄糖銨瓊脂、糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、緩沖葡萄糖蛋白胨水、V-P試劑、甲基紅試劑、氧化酶試劑、革蘭氏染液、志賀氏菌屬診斷血清等。4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟41 志賀氏菌檢驗(yàn)程序（如圖33-1）42 增菌稱(chēng)取檢樣25g加入裝有225mL GN增菌液的500mI廣口瓶?jī)?nèi)（固體食品應(yīng)用均質(zhì)器以8，00010，000r/mi打碎1min，或用研缽研碎），于培養(yǎng)361培養(yǎng)68h。檢 樣25gGN 225mlHE瓊脂或SS麥康覬或EMB挑取可疑菌落TSI，葡萄糖半固體36，68h36，1824hTSI底層產(chǎn)酸，斜面產(chǎn)堿， H2S，不產(chǎn)氣，無(wú)動(dòng)力非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果血清學(xué)分型生化分群試驗(yàn)志賀氏菌屬分群及分型結(jié)果進(jìn)一步的生化試驗(yàn)葡萄糖銨試驗(yàn)、西蒙氏檸檬酸鹽、賴(lài)氨酸、尿素、KCN、水楊苷和七葉苷葡萄糖銨或任何其他陽(yáng)性結(jié)果非志賀氏菌非志賀氏菌報(bào) 告圖33-1 志賀氏菌檢驗(yàn)程序43 分離 取一環(huán)增菌液，劃線(xiàn)接種于HE瓊脂平板或SS平板一個(gè)，麥康凱瓊脂平板或伊紅美蘭瓊脂平板一個(gè)，于361培養(yǎng)1824h.。志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無(wú)色透明的中等大小的光滑型菌落。44 生化試驗(yàn)（1）志賀氏菌屬生化特性試驗(yàn)挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和半固體瓊脂各一管。志賀氏菌在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果為底層產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可微產(chǎn)氣)，斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn)生硫化氫，無(wú)動(dòng)力，在半固體管內(nèi)沿穿剌線(xiàn)生長(zhǎng)。然后再做V-P苯丙氨酸脫氨酶、賴(lài)氨酸脫羧酶、西蒙氏檸檬酸鹽和葡萄糖銨試驗(yàn)，結(jié)果均應(yīng)陰性反應(yīng)。（2）志賀氏菌屬分群生化試驗(yàn) 要將志賀氏菌屬分群，應(yīng)做5%乳糖、甘露醇、棉子糖和甘油的分解試驗(yàn)，靛基質(zhì)試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表33-1。要將志賀氏菌屬分型，還需進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，具體為：挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，作玻片凝集試驗(yàn)。先用四種志賀氏菌多價(jià)血清檢查，若因K抗原的存在而凝集被阻，應(yīng)煮沸菌液破壞K抗原后再檢查。若呈現(xiàn)凝集，則用A1、A2群多價(jià)和D群血清分別試驗(yàn)。如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別試驗(yàn)，確定菌型。福氏志賀氏菌各型和亞型的型和群抗原的血清學(xué)鑒定見(jiàn)表33-2、33-3。表33-1 志賀氏菌屬四個(gè)群的生化特性生化群5%乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基質(zhì)A群：痢疾志賀氏菌-（+）-/+B群：福氏志賀氏菌-+-/+C群：鮑氏志賀氏菌-+-+-/+D群：宋內(nèi)志賀氏菌+/（+）+d-注：+陽(yáng)性，-/+多數(shù)陰性，少數(shù)陽(yáng)性，（+）遲緩陽(yáng)性，d不同生化型。福氏志賀氏6型生化特性與A或C群相似。表33-2 福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗