62-EB病毒(EBV)核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(熒光PCR法).doc

北京泰普舜康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所作業(yè)指導(dǎo)書 編號(hào)：BJTIB-SOP-PCR062 EB病毒（EBV）核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（熒光PCR法） 第一版 第9頁 共6頁 第0次修改 EB病毒（EBV）核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（熒光PCR法）1.目的規(guī)范EB病毒核酸DNA（熒光PCR法）檢測操作流程，準(zhǔn)確進(jìn)行EB病毒DNA分析。2.應(yīng)用范圍使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司EB病毒核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測試劑盒（熒光PCR法）和Mx3000P熒光定量PCR儀、Roche480熒光定量PCR儀進(jìn)行EB病毒DNA檢測。3.職責(zé)由PCR實(shí)驗(yàn)室制定程序文件，專業(yè)技術(shù)人員負(fù)責(zé)執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)室主管負(fù)責(zé)監(jiān)督實(shí)施。4.內(nèi)容 4.1 實(shí)驗(yàn)原理及其臨床應(yīng)用 本試劑盒用一對EB病毒（EBV）特異性引物和一條EB病毒（EBV）特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴(kuò)增法檢測EB病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA的測定，為臨床提供參考，4.2 標(biāo)本采集4.2.1 使用標(biāo)本類型：全血。4.2.2 標(biāo)本采集；由合作單位按照以下要求進(jìn)行采集。4.2.2.1全血：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。4.2.3 標(biāo)本保存和運(yùn)送：標(biāo)本可立即用于測試，也可以保存于-20待測，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送采用0冰壺。4.3 試劑準(zhǔn)備4.3.1 供應(yīng)商：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。4.3.2 此實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)放在冰箱-20保存，在實(shí)驗(yàn)前5分鐘取出備用，實(shí)驗(yàn)后應(yīng)立即放回冰箱-20。4.3.3 如果試劑出現(xiàn)了封口蠟破損導(dǎo)致液體外漏以及過期試劑，應(yīng)及時(shí)更換。4.4 質(zhì)控品4.4.1 質(zhì)控品來源：隨試劑盒，由廠家提供。4.4.2 質(zhì)控品保存條件：置于-20冰箱中保存。4.4.3 質(zhì)控頻度：每次實(shí)驗(yàn)均需做質(zhì)控。4.5 操作過程說明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 質(zhì)控品處理：取出陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品。8000rpm離心數(shù)秒，吸50ul至0.5ml滅菌離心管中，加入50ulDNA提取液充分混勻，100恒溫處理101分鐘；12000 rpm離心5分鐘，備用。4.5.1.2 樣本處理4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃試管中，加入生理鹽水500ul輕搖混勻；4.5.1.2.2 取干燥玻璃試管加入1ml淋巴細(xì)胞分離液； 4.5.1.2.3 將稀釋好的全血用移液器緩慢加入加有淋巴細(xì)胞分離液的試管中(注意沿著管壁，速度要慢)；4.5.1.2.4 2000rpm離心20分鐘（建議用水平離心機(jī)）； 4.5.1.2.5 吸取白細(xì)胞層(從上往下第二層)，加入1.5ml離心管，12000rpm離心5分鐘；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混勻，100恒溫處理101分鐘； 12000rpm離心5分鐘，上清備用。4.5.2.1 加樣：取PCR反應(yīng)管若干，加入處理后的樣品（標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、臨界或強(qiáng)陽性質(zhì)控品）上清液5ul,8000rpm離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。4.5.3 PCR擴(kuò)增 將準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管放置于PCR儀上，編輯樣本信息并按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：37-2min；94-2min；（94-15ses；55-45ses）40 cyclics； EBV檢測熒光素：FAM; 反應(yīng)體系：50ul； 熒光信號(hào)收集：55-45ses，末端收集。4.5.3 Mx3000P熒光定量PCR儀的設(shè)置及結(jié)果分析4.5.3.1 打開計(jì)算機(jī)電源。4.5.3.2 將Mx3000P電源開關(guān)打開，在大約1分鐘的時(shí)間內(nèi)，儀器將會(huì)自檢并且能聽到濾鏡輪轉(zhuǎn)動(dòng)的聲音。打開電腦上的Mx3000P軟件，確定軟件界面右下面的聯(lián)機(jī)標(biāo)志呈現(xiàn)綠色。如果不是綠色而是紅色，軟件會(huì)提示，這時(shí)只需要繼續(xù)稍等片刻，待儀器自檢完成，會(huì)自動(dòng)連接計(jì)算機(jī)。4.5.3.3 在軟件的彈出框中選擇您要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)類型，通常選擇第一項(xiàng)“Quantitive PCR（Multiple Standards）”進(jìn)行絕對定量分析。4.5.3.4 確定鹵鎢燈已經(jīng)打開。(綠色)則說明鹵鎢燈已經(jīng)打開；（黃色）則說明鹵鎢燈正在預(yù)熱；（紅色）則說明鹵鎢燈沒有被打開，這時(shí)需要用鼠標(biāo)點(diǎn)擊這個(gè)標(biāo)志將光源打開。在鹵鎢燈已經(jīng)被打開的情況下，軟件界面右下方會(huì)顯示（綠色）。4.5.3.5 最好在儀器與光源預(yù)熱20分鐘后開始實(shí)驗(yàn)。4.5.3.6 在里，對所選孔進(jìn)行設(shè)定，在Well type中設(shè)定Standard（標(biāo)準(zhǔn) 品）、NTC（陰性對照）、unkown（樣品）等，并選擇正確的熒光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），參比熒光（Reference dye）選None。對于標(biāo)準(zhǔn)品，在Well type中設(shè)定為“Standard”后，再設(shè)定其模板濃度。方法為：點(diǎn)擊 ，10倍的濃度梯度可以直接點(diǎn)擊，在下拉菜單中選擇不同的系數(shù)關(guān)系后，依次點(diǎn)擊設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)品的另外幾個(gè)孔，濃度將實(shí)時(shí)顯示。也可以直接點(diǎn)擊標(biāo)準(zhǔn)品的各個(gè)孔位， 在一欄，手工輸入濃度。若要對不同的樣品進(jìn)行編號(hào)，則雙擊所選孔，在name框中輸入樣品號(hào)，點(diǎn)擊就能顯示樣品編號(hào)?；蛘唿c(diǎn)擊版面右上方的，導(dǎo)入以前使用的96孔板設(shè)定。4.5.3.7 點(diǎn)擊，進(jìn)行PCR循環(huán)的設(shè)定，可以直接點(diǎn)擊溫度、時(shí)間改變各項(xiàng)溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。在選定大步驟之后添加步驟可選定該大步驟后，點(diǎn)擊，或點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在彈出的對話框中，選擇Add Segment，則可在該大步驟之后添加一個(gè)大步驟；若是在選定大步驟里面的小步驟后邊添加一小步驟，選中該小步驟，點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在彈出的對話框中選擇“Add Plateau with Ramp”。要?jiǎng)h除某個(gè)大步驟，直接選定大步驟，點(diǎn)擊界面右邊的“”，或者點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵選Delete，即可刪除該步驟。如果要?jiǎng)h除一個(gè)大步驟里的小步驟，可先選定此步驟時(shí)間和溫度中間的橫線，將其變紅，如圖，點(diǎn)擊界面右邊的“”，或者點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵選Delete，即可刪除該步驟。點(diǎn)擊，導(dǎo)入以前設(shè)定的PCR程序。（END）代表在這一步結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)；（ALL）代表在這一步的全過程都采集熒光信號(hào)，一般用作熔解曲線分析?？芍苯佑檬髽?biāo)將此圖標(biāo)拖到要采集信號(hào)的地方。若要去除，可將其拖出循環(huán)設(shè)定區(qū)域。4.5.3.8 結(jié)束之后，點(diǎn)擊軟件界面右上方的。會(huì)彈出對話框提示：儀器燈源正在預(yù)熱，需要“馬上運(yùn)行”或者是“燈預(yù)熱完成后再運(yùn)行”？通?？芍苯狱c(diǎn)擊“馬上運(yùn)行”，但最好點(diǎn)擊“燈預(yù)熱完成后再運(yùn)行”，可以保護(hù)燈源。軟件界面右下方會(huì)出現(xiàn)運(yùn)行狀態(tài)顯示框Run Status，點(diǎn)擊Start開始實(shí)驗(yàn)。在運(yùn)行過程中可以通過點(diǎn)擊Add Cycles來增加擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)。還可以選擇勾選“Turn lamp off at end of run”，在PCR運(yùn)行結(jié)束之后軟件將自動(dòng)關(guān)閉鹵鎢燈。4.5.3.9 在PCR運(yùn)行的過程中可以點(diǎn)擊，觀察樣品的實(shí)時(shí)擴(kuò)增原始結(jié)果。4.5.3.10 PCR運(yùn)行結(jié)束后，點(diǎn)擊，再點(diǎn)擊Results，軟件將自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果分析，也可點(diǎn)擊手動(dòng)進(jìn)行結(jié)果分析?？梢允謩?dòng)調(diào)節(jié)閾值線（拖動(dòng)）進(jìn)行分析。點(diǎn)擊可顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線，看斜率、截距、線性相關(guān)是否在可控范圍內(nèi)。左下角的可選擇相應(yīng)的熒光觀察擴(kuò)增曲線。右邊的可根據(jù)自己的需要選擇顯示的界面。是擴(kuò)增曲線，Ct值列表，標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本起始濃度，結(jié)果excel表格輸出，合并面板，包括設(shè)置、程序設(shè)定、樣本Ct值、擴(kuò)增曲線四個(gè)面板。4.5.3.11 分析曲線時(shí)，如果曲線不夠光滑，還能用中的Smoothing對曲線進(jìn)行調(diào)節(jié)，一般Amplification average是3，可按需要將其調(diào)至較大數(shù)值，如5、7、9，調(diào)整后曲線將更光滑，不過Ct值會(huì)稍微靠后一點(diǎn)，使數(shù)據(jù)失真，通常情況下，不建議這么做。4.5.3.12 如果需要對每條曲線進(jìn)行單獨(dú)的基線設(shè)置，點(diǎn)擊中的Baseline Correction，點(diǎn)擊Adaptive baseline，在下面對應(yīng)的各孔，單獨(dú)進(jìn)行基線起始和終止位置的調(diào)節(jié)。 4.5.3.13 關(guān)于Mx3000P調(diào)用前一次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的補(bǔ)充說明。點(diǎn)擊桌面Mx3000P的軟件圖標(biāo)，彈出話框：選擇Multiple Experiment Analysis （多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析）選項(xiàng)，點(diǎn)擊“OK”，出現(xiàn)如下對話框，建議選擇“Use common threshold”進(jìn)行分析進(jìn)算，然后點(diǎn)擊，導(dǎo)入需要一起分析的上機(jī)文件，點(diǎn)擊“Finish”即可。4.5.3.14 這里選擇時(shí)要注意：1.兩個(gè)或者多個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有相同的實(shí)驗(yàn)程序 ；2.每次程序中的循環(huán)數(shù)應(yīng)該一致。在分析欄可以選擇不同實(shí)驗(yàn)的不同反應(yīng)孔進(jìn)行同步分析。4.5.3.15 分析質(zhì)控結(jié)果：陰性質(zhì)控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。陽性質(zhì)控品：EBV（FAM）Ct值33，且有較好的對數(shù)增長曲線。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新檢測。4.5.3.16 記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。4.5.3.17 取出結(jié)束后擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后，丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴(kuò)增管破裂而導(dǎo)致污染。4.5.4 Roche480熒光定量PCR儀的設(shè)置及結(jié)果分析4.5.4.1 先打開電腦，再打開熒光定量PCR儀器，然后雙擊圖標(biāo)“”，打開儀器數(shù)據(jù)庫。4.5.4.2 雙擊圖標(biāo)“”，啟動(dòng)羅氏480軟件。4.5.4.3 在彈出的對話框中，輸入用戶名和密碼，進(jìn)入軟件設(shè)置界面。4.5.4.4 在彈出的界面中，點(diǎn)擊“”，進(jìn)入新的實(shí)驗(yàn)設(shè)置界面：。 4.5.4.5 在“”菜單欄里，“”子菜單下。 4.5.4.6 將“Detection Format”選擇為Daul或3 color的探針雜交類型。4.5.4.7 將“Reaction Volume”設(shè)置為“50ul”。4.5.4.8 在“Programs”下：通過“”“”來增加總的循環(huán)階段及階段的循環(huán)數(shù)，并在“變性延伸退火”循環(huán)階段的“Analysis Mode”下選擇Quantification。4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通過“”“”來增加每個(gè)循環(huán)階段里的小步驟，并在采集熒光的小步驟的“Acquisition Mode”里選擇“single”，采集熒光。4.5.4.10 在“”菜單欄下，通過“”增加或者減少實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型，通過右邊的孔位選擇，設(shè)置不同項(xiàng)目的區(qū)域，然后點(diǎn)擊“Apply”保存。4.5.4.11 在“”菜單欄下，Step 1處，選擇“Abs Quant”；Step 2處，編輯標(biāo)準(zhǔn)品及樣本。 4.5.4.12 標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置：在Step 2下的96孔面板中，選中標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔，然后選擇右側(cè)的模 板檢測通道，如“483-533”，然后將下方孔位的“Quantification Sample Type”選擇為“Standard”，并在“Concentration”處輸入其濃度即可。4.5.4.13 樣本設(shè)置：類似于標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置，但僅需要編輯其“Sample Name”即可。4.5.4.14 返回“”菜單，在“”子菜單右下角點(diǎn)擊“”，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。4.5.4.15 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在“”菜單下，選擇“Abs Quant/Fit Points”，進(jìn)入結(jié)果分析界面： 【Analysis】：在此菜單下對閾值線進(jìn)行調(diào)整；【Noise Band】：對實(shí)驗(yàn)的信噪比進(jìn)行調(diào)整；【Filter Comb】：對不同熒光通道進(jìn)行選擇；【Std Curve】：對定量參考品進(jìn)行選擇，包括實(shí)驗(yàn)中的參考品、導(dǎo)入的標(biāo)準(zhǔn)品等；4.5.4.16 在上述操作完成后，點(diǎn)擊“”；在“”菜單中，根據(jù)需要選擇報(bào)告中需包含的項(xiàng)目，然后得出結(jié)果。4.5.4.17 分析質(zhì)控結(jié)果：陰性質(zhì)控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。陽性質(zhì)控品：EBV（FAM）Ct值33。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新檢測。4.5.4.18 記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。4.5.4.20 取出結(jié)束后擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后，丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴(kuò)增管破裂而導(dǎo)致污染。4.5.4.21 關(guān)閉擴(kuò)增儀電源和計(jì)算機(jī)電源。4.6 結(jié)果判定EBV陽性：（EBV-FAM）Ct36，且有較好的對數(shù)增長曲線。EBV陰性：（EBV -FAM）Ct值=40或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。EBv檢測灰度區(qū)：（EBV -FAM）36