第二章-微生物菌種選育.ppt

第二章微生物菌種選育 黃小龍農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)系 本章主要內(nèi)容 第一節(jié)菌種的來源第二節(jié)菌種選育第三節(jié)微生物菌種的擴大培養(yǎng)第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯 第一節(jié)菌種的來源 一 工業(yè)發(fā)酵常見微生物種類1 細菌發(fā)酵工業(yè)常用的細菌大多是桿菌 枯草桿菌 醋酸桿菌 棒狀桿菌 乳酸桿菌 梭狀芽孢桿菌 大腸桿菌等 4 一 工業(yè)發(fā)酵常見微生物種類2 酵母菌發(fā)酵工業(yè)常用的酵母 釀酒酵母 異常漢遜氏酵母異常變種 假絲酵母屬 畢赤氏酵母屬等 5 一 工業(yè)發(fā)酵常見微生物種類3 霉菌發(fā)酵工業(yè)常用的霉菌 曲霉屬 青霉屬 根霉屬 毛霉屬等 4 其他放線菌 擔(dān)子菌 藻類等 6 二 工業(yè)微生物來源根據(jù)資料直接向有科研單位 高等院校 工廠或菌種保藏部門索取或購買 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株 三 微生物菌種的選擇性分離 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 菌種的特性 采用各種篩選方法 快速 準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來 實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌 也必須重新進行分離純化 有了優(yōu)良的菌種 還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合 1 分離思路 定方案 首先要查閱資料 了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性 采樣 有針對性地采集樣品 增殖 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 在數(shù)量上占優(yōu)勢 分離篩選 采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的菌 發(fā)酵性能測定 進行生產(chǎn)性能測定 這些特性包括形態(tài) 培養(yǎng)特征 營養(yǎng)要求 生理生化特性 發(fā)酵周期 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 耐受最高溫度 生長和發(fā)酵最適溫度 最適pH值 提取工藝等 2 新種分離與篩選的步驟 一 采樣 1 采樣對象以采集土壤為主 一般園田土和耕作過的沼澤土中 以細菌和放線菌為主 富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 酵母和霉菌較多 如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi) 采樣的對象也可以是植物 腐敗物品 某些水域等 從自然界篩選 2 采樣季節(jié) 以溫度適中 雨量不多的秋初為好 3 采土方式 在選好適當(dāng)?shù)攸c后 用小鏟子除去表層5cm浮土 取離地面5 25cm處的土約10 25g 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 扎好 標(biāo)記 記錄采樣時間 地點 環(huán)境條件等 以備查考 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 宜將樣品逐步分批寄回 以便及時分離 采取土壤樣品要考慮的幾個問題 土質(zhì)肥 微生物含量高 特別肥沃的土壤中細菌多 放線菌少 在植物殘體枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌 離地面5 25cm處的土壤通氣良好 不受陽光直射 含菌量最高 采土季節(jié)以春秋兩季最好 采土方法 選擇適當(dāng)?shù)攸c 鏟除表土 取土樣數(shù)十克 盛入事先準(zhǔn)備的無菌防水紙袋中 其上記錄采土?xí)r間 地點 植被情況等 多點采土 混合分離 可以代表每一地塊上的微生物分布平均情況 二 增殖培養(yǎng) 含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng) 如果原有樣品中目的菌含量低 可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì) 培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長繁殖 從而提高它們在樣品中的比例 便于分離 富集培養(yǎng)的一般方法 采用有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件 以達到使目的菌種在群體中比例上升的目的 例如碳源利用的控制 可選定糖 淀粉 纖維素 或者石油等 以其中的一種為唯一碳源 那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長 而其它微生物就可能死亡或淘汰 某些細菌的富集條件 富集對象接種菌樣添加營養(yǎng)物 g 特殊培養(yǎng)條件好氧氨基酸氧化菌土壤 好氧 pH7 0好氧性芽孢桿菌土壤 巴氏消毒 好氧 pH7 0氨基酸發(fā)酵性梭菌土壤 巴氏消毒 厭氧 pH7 0耐堿解尿素芽孢菌土壤 巴氏消毒尿素50好氧 pH8 6厭氧八疊球菌土壤葡萄糖20厭氧 pH2 3乳酸菌植物體或牛奶葡萄糖20厭氧 pH6 5腸道細菌土壤或污水葡萄糖20 CaCO320好氧或厭氧 pH7 0丙酸菌干酪乳酸鈉20厭氧 pH7 0醋酸菌果實或生啤酒乙醇40好氧 pH6 0注 培養(yǎng)基成分為酵母膏10g KH2PO4或K2HPO41 0g MgSO4 7H2O0 2g 加水1000ml 一般培養(yǎng)在30 下 放線菌的分離 15 放線菌的特性 生長緩慢 難培養(yǎng) 分離要點 1 選擇適合放線菌生長的培養(yǎng)基 如 HV培養(yǎng)基 腐殖酸培養(yǎng)基 2 添加抑制其他細菌和真菌生長的抑制劑 如 重鉻酸鉀 放線菌酮 制霉菌素等 三 培養(yǎng)分離 純種分離的方法 劃線分離法 稀釋分離法 稀釋分離法 稀釋倒平板法 平板涂布法 注意 必須要做多個濃度的稀釋分離平板 劃線分離法 平板劃線法 四 篩選 1 初篩 從分離得到的大量微生物中 將目標(biāo)微生物篩選出來的過程 常用的初選方法 水解酶產(chǎn)生菌的篩選 將酶的作用底物加在培養(yǎng)基中 接種后適溫培養(yǎng) 根據(jù)菌苔周圍是否產(chǎn)生水解圈篩選出水解酶產(chǎn)生 一般采用平板篩選 拮抗菌的篩選 對峙培養(yǎng) 將病原指示菌與待測菌株相對接種在平板上適溫培養(yǎng) 根據(jù)病原菌的生長情況篩選出拮抗性菌株 2 搖瓶發(fā)酵篩選 將待測菌株進行液體振蕩培養(yǎng) 取發(fā)酵濾液進行活力測定 2 復(fù)篩 在初篩的基礎(chǔ)上 進一步鑒定有希望菌株的生產(chǎn)能力強弱的過程 復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后 發(fā)酵液采用精確的分析方法進行測定 復(fù)篩過程中 要結(jié)合培養(yǎng)條件進行 培養(yǎng)條件包括 培養(yǎng)基pH值發(fā)酵溫度供氧量等 五 菌種鑒定 經(jīng)典分類鑒定方法 形態(tài)特征 生理生化特征 血清學(xué)試驗等 現(xiàn)代多相分類鑒定方法 遺傳特性 細胞化學(xué)組分 計算機數(shù)值分析 五 毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的 將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心 尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種 更應(yīng)慎重 據(jù)有的國家規(guī)定 微生物中除啤酒酵母 脆壁酵母 黑曲霉 米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外 其他微生物作為食用 均需通過兩年以上的毒性試驗 第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育 菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù) 其理論基礎(chǔ)是微生物遺傳學(xué) 生物化學(xué)等 而其研究目的是微生物產(chǎn)品的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和發(fā)展新品種為生產(chǎn)不斷地提供優(yōu)良菌種 從而促進生產(chǎn)發(fā)展 目前菌種選育常采用自然選育和誘變育種等方法 帶有一定的盲目性 尚屬于經(jīng)典育種的范疇 隨著微生物學(xué) 生化遺傳學(xué)的發(fā)展 出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo) 原生質(zhì)體融合 代謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法 2 1自然選育在生產(chǎn)過程中 不經(jīng)過人工處理 利用菌種的自然突變而進行菌種篩選的過程叫做自然選育 所謂自然突變就是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變 菌種的自然突變往往有兩種可能性 1 菌種衰退 生產(chǎn)性能下降 2 代謝更加旺盛 生產(chǎn)性能提高 2 2誘變育種2 2 l誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變 所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異 突變主要包括染色體畸變和基因突變二大類 1 染色體畸變是指染色體或DNA片斷的缺失 易位 逆位 重復(fù)等 2 基因突變是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的某一部位發(fā)生變化 又稱點突變 根據(jù)突變發(fā)生的原因又可分為自然突變和誘發(fā)突變 誘發(fā)突變是指用各種物理 化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變 誘變因素的種類很多 有物理的 化學(xué)的和生物的三大類 見P55 表2 1 經(jīng)誘變處理后 微生物的遺傳物質(zhì) DNA和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 從而引起微生物的遺傳變異 2 2 2誘變育種的一般步驟 1 出發(fā)菌株的選擇自然界直接分離到的野生型菌株 經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株 已經(jīng)歷多次育種處理的菌株 2 制備菌懸液待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài) 懸液的均一性和環(huán)境條件 盡可能選擇孢子或單倍體細胞作為誘變對象 避免表型延遲 表型延遲就是指某一突變在DNA復(fù)制和細胞分裂后 才在細胞表型上顯示出來 造成不純的菌落 3 誘變處理根據(jù)誘變劑用量對菌體致死率的曲線選擇合適的處理劑量 一般突變率隨誘變劑量的增大而增高 但達到一定劑量后 突變率會下降 4 突變菌株的篩選 1 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選生物合成途徑的某一步發(fā)生了酶缺陷 合成反應(yīng)不能完成 末端產(chǎn)物不能積累 因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除 32 2 抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變菌株的篩選調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變 使產(chǎn)生的阻遏蛋白不能再和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因 因此不再起反饋阻遏作用 編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變 使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力但仍具有催化活性 從而解除了反饋抑制 抗反饋突變株一般通過抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選 營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株中也可獲得抗反饋突變株 3 組成型突變株的篩選分批限量加入誘導(dǎo)物法 解除菌株對誘導(dǎo)物的依賴交替培養(yǎng)法 4 抗性突變株的篩選抗生素抗性突變抗噬菌體菌株的選育條件抗性突變敏感突變 2 2 3幾種常見的物理 化學(xué)誘變劑的使用方法 1 物理誘變劑 紫外線 X 射線 射線 快中子 特點 導(dǎo)致DNA斷裂缺失 造成不可回復(fù)的缺失突變 誘變效率高 但它可能影響鄰近基因的性能 紫外線是常用的誘變劑 2 化學(xué)誘變劑 堿基類似物 5 BU 脫氨劑 羥胺 亞硝酸 嵌入劑 吖啶類 等 特點 堿基類似物 取代相應(yīng)堿基進入DNA鏈 具有很高的特異性 但回復(fù)突變率高 很少使用 脫氨劑 堿基脫氨或脫氮 引起堿基對轉(zhuǎn)換 造成的遺傳損傷較多 應(yīng)用的范圍較廣 嵌入劑 引起移碼突變 可以造成生化代謝途徑完全中斷 2 3雜交育種發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用誘變育種方法 但是 一個菌種長期使用誘變劑處理之后 其生活能力一般要逐漸下降 例如生長周期延長 孢子量減少 代謝減慢 產(chǎn)量增加緩慢 誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等 因此 有必要利用雜交育種方法 雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合 或接合 使遺傳物質(zhì)重新組合 從中分離和篩選具有新性狀的菌株 1 雜交育種的目的 1 通過雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進行交換和重新組合 從而改變原有菌株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ) 獲得雜種菌株 重組體 2 可以通過雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中 克服長期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷 3 通過雜交 可以擴大變異范圍 改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量 甚至出現(xiàn)新的品種 4 分析雜交結(jié)果 可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律 促進遺傳學(xué)理論的發(fā)展 微生物雜交育種所使用的配對菌株稱為直接親本 由于多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代 因此 直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記 常用的遺傳標(biāo)記有顏色 營養(yǎng)要求和抗藥性等 營養(yǎng)標(biāo)記菌株 即營養(yǎng)缺陷型菌株 是最常用的遺傳標(biāo)記之一 所謂營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體 由于基因突變 它失去了合成某種物質(zhì) 氨基酸 維生素或核苷酸堿基 的能力 在基本培養(yǎng)基上不能生長 大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長 2 遺傳標(biāo)記 2 4原生質(zhì)體融合技術(shù)所謂原生質(zhì)體融合就是把兩個親本的細胞壁分別通過酶解作用加以瓦解 使菌體細胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀體 稱原生質(zhì)體 兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合 由聚乙二醇 PEG 作為助融劑 使它們互相凝集 發(fā)生細胞融合 接著兩親本基因組由接觸到交換 從而實現(xiàn)遺傳重組 在再生成細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子 2 4 1原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性原生質(zhì)體融合技術(shù)有以下優(yōu)點 l 去除了細胞壁的障礙 親株基因組直接融合 交換 實現(xiàn)重組 不需要有已知的遺傳系統(tǒng) 即使是相同接合型的真菌細胞也能發(fā)生原生質(zhì)體的相互融合 并可對原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染 2 原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機會發(fā)生多次交換 產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的重組子 參與融合的親株數(shù)并不限于一個 可以多至三個 四個 這足一般常規(guī)雜交所達不到的 3 重組頻率特別高 因為有聚乙二醇作助融劑 4 可以和其他育種方法相結(jié)合 把由其它方法得到的優(yōu)良性狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單株中 5 可以用溫度 藥物 紫外線等處理 鈍化親株的一方或雙方 然后使之融合 再在再生菌落中篩選重組子 這樣往往可以提高篩選效率 由于以上優(yōu)點 利用原生質(zhì)體融合來培育工業(yè)新菌株已受到國內(nèi)外普遍重視 2 4 2原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟 1 選擇親株選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株 親株帶上遺傳標(biāo)記 測定遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性 2 原生質(zhì)體制備一般采用酶解法除壁 根據(jù)微生物細胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同 采用不同的酶 有時還要采取一些措施 如添加甘氨酸 蔗糖或抗生素等 以提高細胞壁對酶解的敏感性 原生質(zhì)體對滲透壓極其敏感 低滲易引起細胞破裂 一般將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中維持它的穩(wěn)定 3 原生質(zhì)體融合兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合 由聚乙二醇 PEG 作為助融劑 使它們互相凝集 發(fā)生細胞融合 接著兩親本基因組由接觸到交換 從而實現(xiàn)遺傳重組 在再生細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子 4 原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長出細胞壁 恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 菌齡 再生時的溫度 溶菌酶用量和溶壁時間等因素都會影響原生質(zhì)體的再生 5 篩選優(yōu)良性狀融合重組子原生質(zhì)體融合后 來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代稱為融合重組子 融合重組子的檢出方法 直接法將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子高滲再生培養(yǎng)基平板上 直接篩選出原養(yǎng)型重組子 間接法把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上 使親株和重組子都再生成菌落 然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子 篩選出來的融合重組子還需要對它們進行生理生化及生產(chǎn)性能的測定 44 2 5基因工程育種 一 傳統(tǒng)基因工程技術(shù) 通過基因工程菌生產(chǎn)的藥物 疫苗 酶制劑 抗生素等 二 基因的定點突變 突變基因突變庫的建立篩選基因突變庫的篩選基因復(fù)制與遺傳 步驟 在分子水平上 對目標(biāo)基因直接處理 然后通過高通量的篩選方法 提高目標(biāo)蛋白的性能 定點突變 第三節(jié)微生物菌種的擴大培養(yǎng) 種子擴大培養(yǎng) 是指將保存在砂土管 冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后 在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程 這些純種培養(yǎng)物稱為種子 作為種子的準(zhǔn)則 1 菌種細胞的生長活力強 移種至發(fā)酵罐后能迅速生長 遲緩期短 2 生理性狀穩(wěn)定 3 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求 4 無雜菌污染 5 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力 種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間 保證生產(chǎn)水平 3 1種子的制備過程 種子制備的過程大致可分為 實驗室種子制備階段生產(chǎn)車間種子制備階段 一 實驗室種子的制備 一般采用兩種方式 1 對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽 生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基或斜面 靜置培養(yǎng) 培養(yǎng)孢子 孢子可直接作為種子罐的種子 這樣操作簡便 不易污染雜菌 2 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種 可以用液體培養(yǎng)法 通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧 一 孢子的制備 1 細菌孢子的制備細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方 培養(yǎng)溫度一般為37 C 細菌菌體培養(yǎng)時間一般為1 2天 產(chǎn)芽孢的細菌培養(yǎng)則需要5 10天 2 霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米 小米 玉米 麩皮 麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基 培養(yǎng)的溫度一般為25 28 C 培養(yǎng)時間一般為4 14天 比如 青霉菌孢子培養(yǎng) 大米培養(yǎng)基 培養(yǎng)基特點 成本低 米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì) 營養(yǎng)適當(dāng) 要求大米的白點小 有利于孢子的生長 3 放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分 如麩皮 豌豆浸汁 蛋白胨和一些無機鹽等 培養(yǎng)溫度一般為28 C 培養(yǎng)時間為5 14天 二 液體種子制備 1 好氧培養(yǎng) 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種 如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌 S griseus 產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌 S Kanamuceticus 可以用搖瓶液體培養(yǎng)法 將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中 于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng) 獲得菌絲體 短菌絲 作為種子 試管 三角瓶 搖床 種子罐 2 厭氧培養(yǎng) 對于酵母菌 啤酒 葡萄酒 清酒等 試管 三角瓶 卡式罐 種子罐 二 生產(chǎn)車間種子制備 實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng) 種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異 但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖 玉米漿 磷酸鹽等 如果是需氧菌 同時還需供給足夠的無菌空氣 并不斷攪拌 使菌 絲 體在培養(yǎng)液中均勻分布 獲得相同的培養(yǎng)條件 1 種子罐的作用主要是使孢子發(fā)芽 生長繁殖成菌 絲 體 接入發(fā)酵罐能迅速生長 達到一定的菌體量 以利于產(chǎn)物的合成 2 種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù) 是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù) 一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù) 但有時 工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù) 種子罐級數(shù)取決于 菌種生長特性 如菌種傳代后的穩(wěn)定性 孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度 采用發(fā)酵罐的容積 發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量 種子液體積 培養(yǎng)液體積 以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān) 細菌 生長快 種子用量比例少 級數(shù)也較少 二級發(fā)酵 茄子瓶 種子罐 發(fā)酵罐霉菌 生長較慢 如青霉菌 三級發(fā)酵孢子懸浮液 一級種子罐 27 C 40小時孢子發(fā)芽 產(chǎn)生菌絲 二級種子罐 27 C 10 24小時 菌體迅速繁殖 粗壯菌絲體 發(fā)酵罐放線菌 生長更慢 采用四級發(fā)酵酵母 比細菌慢 比霉菌 放線菌快 通常用一級種子 二級發(fā)酵 確定種子罐級數(shù)需注意的問題 1 種子級數(shù)越少越好 可簡化工藝和控制 減少染菌機會 2 種子級數(shù)太少 接種量小 發(fā)酵時間延長 降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率 增加染菌機會 3 與所選用工藝條件有關(guān) 如改變種子罐的培養(yǎng)條件 加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖 也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù) 3 2種子質(zhì)量的控制 一 影響孢子質(zhì)量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間和冷藏時間 1 培養(yǎng)基 生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象 其主要原因是原材料質(zhì)量波動 例如在四環(huán)素 土霉素生產(chǎn)中 配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮 因小麥產(chǎn)地 品種 加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同 蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同 原材料質(zhì)量的波動 起它要作用的是其中無機離子含量不同 如微量元素Mg2 Cu2 Ba2 能刺激孢子的形成 磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量 水質(zhì)的影響 地區(qū)不同 季節(jié)變化和水源污染 均可造成水質(zhì)波動 影響種子質(zhì)量 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落 氮源品種越多 出現(xiàn)的菌落類型也越多 不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定 措施 培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用 嚴格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量 斜面培養(yǎng)基使用前 需在適當(dāng)溫度下放置一定時間 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源 作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機氮源 2 培養(yǎng)條件 1 溫度溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響 如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37 C培養(yǎng)時 孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢 氨基氮回升提前 菌絲過早自溶 效價降低等現(xiàn)象 一般各生產(chǎn)單位都嚴格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度 2 濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響 3 培養(yǎng)時間和冷藏時間 1 培養(yǎng)時間一般來說 衰老的孢子不如年輕的孢子 過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降 措施 孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多 孢子成熟 發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng) 2 冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān) 如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4 C冰箱保存 發(fā)現(xiàn)冷藏7 8天菌體細胞開始自溶 而培養(yǎng)5天以后冷藏 20天未發(fā)現(xiàn)自溶 冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響 例如在鏈霉素生產(chǎn)中 斜面孢子在6 C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18 冷藏3個月后降低35 4 接種量 接種量 指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例 接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量 進而影響菌體的生理狀況 二 影響種子質(zhì)量的因素及控制 孢子的質(zhì)量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量 1 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基 營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用 營養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全 氮源和維生素含量要高 營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近 例 檸檬酸發(fā)酵 以蔗糖為原料 成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2 5 5 20 NH4NO30 225 0 11 K2HPO40 03 MgSO4 H2O0 025 0 025 KCl0 015 瓊脂2 薯干粉 成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10 22 28 NH4 2SO40 5 瓊脂2 2 培養(yǎng)條件 1 溫度 2 通氣量 3 pH 3 種齡種齡 是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間 通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期 菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適 不同菌種或同一菌種工藝條件不同 種齡是不一樣的 一般需經(jīng)過多種實驗來確定 Ru嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶 12小時最好 4 接種量通常接種量 細菌1 5 酵母菌5 10 霉菌7 15 有時20 25 三 種子質(zhì)量的控制措施 1 菌種穩(wěn)定性的檢查 2 無雜菌檢查 四 種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1 細胞或菌絲形態(tài)單細胞 菌體健壯 菌形一致 均勻整齊 有的還要求有一定的排列或形態(tài) 霉菌 放線菌 菌絲粗壯 對某些染料著色力強 生長旺盛 菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好 2 生化指標(biāo)種子液的糖 氮 磷的含量和pH變化 3 產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中 產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo) 因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度 4 酶活力種子液中某種酶的活力 與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián) 第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯 一 菌種保藏的意義菌種保藏是進行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分 其任務(wù)首先是使菌種不致死亡 同時還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化 二 菌種保藏的原理 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低 以減少其變異 一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài) 干燥和低溫 使菌種處于 體眠 狀態(tài) 抑制其繁殖能力 一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變 同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟 以便生產(chǎn)上能推廣使用 菌種保藏的方法很多 一般有下面幾種 A斜面冰箱保藏法 酵母 斜面保藏是一種短期 過渡的保藏方法 用新鮮斜面接種后 置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后 放在4 冰箱保存 一般保存期為三個月到六個月 B石蠟油封存法 酵母 向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上 倒入一層滅過菌的石蠟油 用量要高出斜面一厘米 然后保存在冰箱中 此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細菌 霉菌 酵母等微生物的保存 保存期約一年左右 三 菌種保藏的方法 C沙土管保藏法 細菌 霉菌 放線菌 適合于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物 制備方法 首先 將沙與土洗凈烘干過篩后 按沙與土的比例為l 2 l混合均勻 分裝于小試管中 裝料高度約為1厘米左右 121 C間歇滅菌三次 滅菌試驗合格后烘干備用 一般沙用80目過篩 土用30 100目過篩 其次 將斜面孢子制成孢子懸浮液接入沙土管中或?qū)⑿泵骀咦庸蜗轮苯优c沙土混合 于干燥器中用真空泵抽干 放在冰箱內(nèi)保存 一般保存期為1年左右 D真空冷凍干燥保藏法 細菌 放線菌 真空冷凍干燥保藏法是目前常用的較理想的一種方法 其基本原理是在較低的溫度下 15 快速地將細胞凍結(jié) 并且保持細胞完整 然后在真空中使水分升華 在這樣的環(huán)境中 微