植物脫毒和快速繁殖技術(shù)

第七章植物脫毒和快速繁殖技術(shù) 組員 賀秀娟葉研春韓婷花韓秀麗白秉元馬延梅 第一節(jié)植物脫毒的原理 一熱處理脫毒1 高溫短時處理法這種方法是利用病毒與植物耐熱能力的不同 將木苗 接穗或種子等繁殖材料在一定的高溫下處理一段時間 將其體內(nèi)的病原殺死或鈍化 失去侵染能力 而保持其本身的生活力 從而達(dá)到脫毒的目的 該法尤其適用于類菌原體 類細(xì)菌的脫毒 而對于類病毒的脫毒效果較差 因為類病毒通常有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性 這種處理方法與1921年首先用于甘蔗的脫毒 國內(nèi)用這種方法處理柑橘 可脫除柑橘材料內(nèi)的黃龍病類細(xì)菌 2低熱長時處理法低熱長時處理一般不能使整株植株脫毒 而只能使個別器官脫毒 大多是使在熱處理過程中長出的莖尖無病毒 因此 處理的最后步驟是要取新產(chǎn)生的莖尖嫁接到無毒實生碊木上或?qū)⑿庐a(chǎn)生的莖尖進(jìn)行扦插繁殖 以獲得脫病毒植株 但對不同病毒及不同植物種類的脫毒率差異很大 二 組織培養(yǎng)脫毒1 莖尖培養(yǎng)脫毒Morel等 1952 首先從感染有花葉病毒的大麗花上分離出莖尖分生組織 0 25mm 培養(yǎng)得到植株 嫁接在大麗花實生砧木上檢驗未無病毒植株 從此 莖尖培養(yǎng)就成為脫去病毒的一個有效途徑 并相繼在馬鈴薯 菊花 蘭花等莖尖培養(yǎng)脫毒的研究中獲得成功 莖尖培養(yǎng)脫毒可脫除多種病毒 類病毒 類菌原體和類立克次體 很多不能通過熱處理脫除的病毒可以通過莖尖培養(yǎng)而脫掉 莖尖培養(yǎng)脫毒直接從莖尖生長獲得植株 很少有變異 能很好地保持品種的特性 莖尖培養(yǎng)之所以能脫除病毒 是因為感染病毒的植株的幼嫩及未成熟的組織和器官中病毒含量較低 生長點 約0 1 1 5mm區(qū)域 則幾乎不含病毒或含病毒很少 植物莖尖等分生組織中不含或很少含有病毒的原因 1 植物莖尖分生組織中胞間連絲發(fā)育不完全或太細(xì) 使病毒在細(xì)胞之間的擴(kuò)散作用受到抑制 2 病毒復(fù)制 運(yùn)輸速度與莖尖細(xì)胞生長速度不同 病毒向上運(yùn)輸速度慢 而而分生組織細(xì)胞繁殖快 結(jié)果使莖尖區(qū)域部分的細(xì)胞沒有病毒 3 植物生長點細(xì)胞中缺少病毒增值的感受點 因而復(fù)制過程不能進(jìn)行 4 莖尖等分生組織中存在抑制 鈍化病毒的物質(zhì) 5 莖尖或其他組織在培養(yǎng)過程中病毒被鈍化或抑制 2 莖尖微芽嫁接脫毒 莖尖微芽嫁接脫毒是組織培養(yǎng)與嫁接相結(jié)合 用以獲得無病毒苗木的一種新技術(shù) 他將0 1 0 3mm的莖尖作為接穗 嫁接到由試管中培養(yǎng)出來的無毒實生砧木上 繼而進(jìn)行試管培養(yǎng) 愈合成為完整植株的脫毒方法 它可消除用熱處理不能除去的一些病毒 如衰退病毒 木質(zhì)陷孔病毒 黃脈病毒等 莖尖微芽嫁接脫毒可以解決一些果樹莖尖培養(yǎng)成苗難 特別是生根困難的問題 有些果樹種類或品種 如格瑞弗斯蘋果通過莖尖組織培養(yǎng) 可以獲得無病毒新梢 但不能生根 只有通過莖尖微芽嫁接脫毒才能獲得完整植株 3 其他外植體的組織培養(yǎng)方法脫毒 除莖尖培養(yǎng)外 還可從花粉 花藥 胚 胚珠及珠心等組織培養(yǎng)獲得無病毒的植株 這些器官或組織也是植株中含病毒較少的部位 但不同病毒或不同寄主植物使他們帶毒或不帶毒的情況各不相同 采用這些器官脫毒時 首先應(yīng)弄清楚其帶毒情況 關(guān)于一些植物種胚中不攜帶病毒的原因有兩種觀點 一種觀點認(rèn)為病毒不能進(jìn)入胚中 植物子房中胚與其他母體細(xì)胞之間缺少維管束組織和胞間連絲的關(guān)系 另一種是認(rèn)為病毒能進(jìn)入胚 但進(jìn)入后為寄主所消滅 有這樣一種現(xiàn)象 種子在未成熟時帶有病毒 到成熟時 病毒就消失了 這就說明 即使沒有胞間連絲 病毒還可以通過其他途徑進(jìn)入胚中 但是有些植物的種子中存在著一種抑制病毒的物質(zhì) 此外 還有人認(rèn)為是有些種胚中缺少病毒增值所需要的重要物質(zhì) 而使病毒不能復(fù)制 對于一些果樹植物要獲得與親本一致的無性系無病材料 可以從胚囊敗育的子房中在胚囊敗育之前獲取胚珠或珠心組織進(jìn)行培養(yǎng) 花藥或花粉培養(yǎng)也可以作為一種脫毒方法 這種方法可結(jié)合單倍體育種進(jìn)行 用花藥培養(yǎng)進(jìn)行草莓脫毒 脫毒率可達(dá)100 花藥培養(yǎng)獲得的無毒材料多為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的類型 植物的感染病組織中不是所有細(xì)胞都含有病毒 因此 也有人從感病植株分離原生質(zhì)體 愈傷細(xì)胞或其他細(xì)胞 繼而培養(yǎng)獲得植株 然后通過鑒定病毒從中選擇無病的材料 三 其他脫毒方法 1 合并使用熱處理 莖尖培養(yǎng)或微芽嫁接脫毒這種脫毒方法是從經(jīng)熱處理后的新梢頂端切取一段嫩梢 再嫁接到事先準(zhǔn)備好的實生砧木上 如果用徒手嫁接 枝梢的長度至少要達(dá)到1 0 1 5cm方可 若要使這樣長的嫩梢無病毒 對于蘋果至少須熱處理3 4周 而一些耐熱性弱的品種 在熱處理期間 因高溫傷害 大部分枯死 或嫁接后成活率很低 用莖尖培養(yǎng)脫毒 需要用很小的莖尖才能脫除病毒 通常采用的莖尖大小為0 1 0 2mm 因莖尖太小往往成活率很低 對于莖尖嫁接也有類似情況 莖尖太小往往不能成活 因此 莖尖培養(yǎng) 莖尖嫁接不僅很難操作 而且一些病毒不能脫去 如單純的莖尖嫁接不能脫除柑橘碎葉病毒 合并使用熱處理 莖尖培養(yǎng)或莖尖嫁接能克服兩種方法各自的缺點 不僅可完全脫除病毒 同時莖尖成活率也得到提高 由此可大幅度延長熱處理時間 增大用于培養(yǎng)的莖尖長度 目前國內(nèi)外葡萄 蘋果的脫毒多采用熱處理莖尖培養(yǎng)方法 柑橘則都采用熱處理與莖尖嫁接相結(jié)合的辦法 兩種組合均提高了獲得無病毒苗木的可能性 2 冷處理結(jié)合莖尖培養(yǎng) 有些作物對高溫非常敏感 可用冷處理代替熱處理并結(jié)合莖尖培養(yǎng)來脫毒 如三葉草的脫毒 將準(zhǔn)備切去莖尖的母株在取莖尖之前 放在10 中經(jīng)過2 4個月 以代替熱處理 可以部分去除病毒 這種方法也有人用于從馬鈴薯上消除梭狀塊莖類病毒 3 化學(xué)處理結(jié)合莖尖培養(yǎng) 目前尚無一種抗病毒藥劑能從整株植株消毒病毒 但某些病毒抑制劑或鈍化劑加到組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中卻能消除培養(yǎng)組織中的病毒 Ribavirin 抗病毒醚 是一種對DNA病毒或RNA病毒具有廣譜作用的人工合成物質(zhì) Hansen等將其噴布在昆諾阿藜上 然后接種CLSV SGV等 種病毒 結(jié)果對CLSV的增值有很強(qiáng)的抑制效果 但對SGV 桃壞死環(huán)斑病毒 葡萄扇葉病毒 李矮化病毒無效 在一年生蘋果生長期間 每隔7天噴布1次5 10 4抗病毒醚溶液 第二年春仍從蘋果苗中檢出了CLSV 若在培養(yǎng)基中加入抗病毒醚進(jìn)行蘋果莖尖培養(yǎng) 可脫除 山家弘土用含抗病毒醚 25 0的培養(yǎng)基培養(yǎng)用熱處理 莖尖培養(yǎng)未能脫除SGV的試管苗莖尖 處理時間為 天 在各處理區(qū)增殖的新梢中任選一株 切取頂端部分長 每隔 天更換 次新的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng) 最后繼代到無藥劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 天后檢測病毒 天處理的部分脫除了SGV 而 天兩個濃度的處理均全部脫除病毒 對照則仍 帶毒 對蘋果莖尖有一定的要害 而 處理無明顯藥害 據(jù)分析 抗病毒醚不是直接作用于病毒 而是作用于寄主的代謝 從而阻止病毒的增殖 使新梢逐漸脫除病毒 因此 認(rèn)為在果樹植株生長期間定期噴布抗病毒醚 有可能在苗木頂端部分?jǐn)U大無病毒區(qū)域 進(jìn)而可增加莖尖培養(yǎng)的脫毒效率 除抗病毒醚以外 還有報道證明一些其他藥劑也具有同樣的作用 4 合并使用藥劑合并使用化學(xué)藥劑和熱處理有助于提高熱處理脫除病毒類病原的效果 培育株心苗 大多數(shù)植物病毒不通過種子傳播 由此可通過培育株心來獲得無病毒母株 例如大多數(shù)柑橘品種產(chǎn)生兩種完全不同的胚 即合子胚和株心胚 合子胚由受精卵細(xì)胞發(fā)育而來 常稱有性胚 株心胚由母本株心體細(xì)胞發(fā)育而來 常稱無性胚 株心胚在胚囊中發(fā)育 并與合子胚共存 由于株心胚是由母本體細(xì)胞發(fā)育而來 未經(jīng)減數(shù)分裂 因此除個別體細(xì)胞突變外 株心胚長出的實生苗遺傳上與母株完全相同 因此由株心胚獲得的株心苗大多數(shù)病毒被脫除而遺傳特征與母株完全相同 選擇這種類型的株心苗 可應(yīng)用標(biāo)記花粉控制授粉 然后選出典型的實生苗 例如 枳的花粉可用作標(biāo)記花粉 因為所有枳的雜種實生苗都具有三葉特征 很容易辨認(rèn)和排除 培育株心系以獲得無病毒苗有以下優(yōu)點 可以肯定植株不帶毒 花時間少 成本低 方法便于掌握 株心苗長勢強(qiáng) 但株心系童期長 且易出現(xiàn)一些返祖性狀 第二節(jié)植物脫毒操作技術(shù) 一 通過熱處理消除病毒的操作技術(shù)再莖尖培養(yǎng)法建立以前 熱療法一直是從各種植物的受侵染的個體得到無病毒植株的有效方法 熱處理可通過熱水或熱空氣進(jìn)行 熱水處理對休眠芽效果較好 熱空氣處理對活躍生長的莖尖效果較好 既能消除病毒 又能使寄主植物有較高的存活機(jī)會 熱空氣處理比較容易進(jìn)行 把旺盛生長的植物移入到一個熱療室中 在35 40下處理一定時間即可 處理時間的長短 可由幾分鐘到數(shù)周不等 然而 馬鈴薯病毒X PVX 則要求在35下處理幾個月才能得到一些無病毒莖尖 熱處理之后要立即把莖尖切下來嫁接到無病毒的砧木上去 熱處理時 最初幾天空氣溫度應(yīng)逐步增高 直至達(dá)到要求的溫度為止 若鈍化病毒所需的連續(xù)高溫處理會傷害寄主組織 則應(yīng)當(dāng)試驗高低溫交替的效果 在熱處理期間應(yīng)當(dāng)保持適當(dāng)?shù)臐穸群凸庹?根據(jù)Baker和Kinnaman 1973 的試驗 在對香石竹進(jìn)行脫毒熱處理時 相對濕度必須保持在85 95 之間 準(zhǔn)備接受熱處理的植株必須具有豐富的碳水化合物儲備 為達(dá)到這個目的 事先應(yīng)對植物進(jìn)行回縮 Holings 1965 報道 回縮能夠增加植物忍受熱處理的能力 應(yīng)用熱療法消除病毒的一個主要限制在于 并非所有的病毒都對熱處理敏感 例如 在馬鈴薯應(yīng)用這項技術(shù)只能消除卷葉病毒 一般來說 對于病毒等徑的和線狀的病毒 以及對于已知是由類菌原體引起的病害 熱處理是有效的 延長寄主植物的熱處理時間 也可能會鈍化植物組織中的抗性因子 因而和對照相比會降低處理效果 此外 在熱處理之后只有一小部分植株能夠存活 與單獨采用熱療法相比 莖尖培養(yǎng)具有更廣泛的適應(yīng)性 很多不能由單獨的熱處理消除病毒 可以通過莖尖培養(yǎng)和熱處理相結(jié)合 或單獨的莖尖培養(yǎng)而將其消除 二 通過莖尖培養(yǎng)消除病毒 1 莖尖培養(yǎng)術(shù)語國內(nèi)外用來描述莖尖培養(yǎng)這一技術(shù)的術(shù)語很多 在使用上也比較混亂 其中有尖芽培養(yǎng) 副芽培養(yǎng) 苗端培養(yǎng) 苗尖培養(yǎng) 分生組織培養(yǎng) 頂端培養(yǎng)等 但嚴(yán)格地講 上述這些術(shù)語均不能確切地反映出用于組織培養(yǎng)的外植體的性質(zhì) 因為僅僅依靠分生組織的生長錐 完整的頂芽或副芽 通常是不能培育出植株的 有人曾做過試驗 從菊花上切取的1500個生長錐經(jīng)培養(yǎng) 僅有3個長成完整的植株 而作者認(rèn)為這3個生長錐在切取時可能帶有一枚葉原基而未被發(fā)現(xiàn) 多數(shù)試驗表明 要想獲得成功 外植體就必須包括分生組織的生長錐及1至數(shù)枚葉原基 因此建議使用一個折衷的詞即莖尖 或頂端 分生組織培養(yǎng) 在應(yīng)用組織培養(yǎng)方法以獲得無病原菌植株時 所用的外植體可以是莖尖 也可以是莖的頂端分生組織 在這里 頂端分生組織是指最幼齡葉原基上方的一部分 最大直徑約為100 最長長度為250 莖尖則是由頂端分生組織及下方的1 3個幼葉原基一起構(gòu)成的 雖然通過頂端分生培養(yǎng)基消除病毒的機(jī)會較高 但在大多數(shù)研究中 無病毒植物都是通過培養(yǎng)100 1000長的外植體得到的 即通過莖尖培養(yǎng)得到 2 方法進(jìn)行脫毒時 大小合乎脫毒需要的理想的外植體實際上是太小了 很難靠肉眼進(jìn)行制備 因而需要一臺帶有適當(dāng)光源的解剖鏡 8 40 解剖時必須注意防止由于超凈臺的氣流和解剖鏡上碘鎢燈散發(fā)的熱而使莖尖變干 因此莖尖暴露的時間應(yīng)當(dāng)越短越好 使用冷光源燈 熒光燈 或玻璃纖維燈則更為理想 若在一個襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行解剖 也有助于防止這類小外植體變干 與其他類型的組織培養(yǎng)一樣 在進(jìn)行莖尖培養(yǎng)時 首先的一步是獲得表面不帶病原菌的外植體 一般來說 莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán)密保護(hù) 只要仔細(xì)解剖 無須表面消毒就應(yīng)當(dāng)?shù)玫綗o菌的外植體 如有可能 應(yīng)把供試植株種在無菌的盆土中 并放在溫室中進(jìn)行栽培 在澆水時 水要直接澆在土壤上 而不要澆在葉片上 此外 還要給植株定期噴施內(nèi)吸性殺菌劑 Wang和Hu 1980 所用的殺菌劑混合液含有殺真菌藥劑苯菌靈 0 1 和抗生素鏈霉素 0 1 使用這種殺菌劑混合液 對于田間種植的材料是格外重要的 對于某些田間植株上直接取來的枝條污染問題小得多 盡管莖尖區(qū)域是高度無菌的 在切取外植體之前一般仍須對莖尖進(jìn)行表面消毒 根據(jù)Wang和Hu 1980 的做法 葉片包被緊實的芽 如菊花 菠蘿 姜和蘭花等 只需在75 乙醇中浸蘸一下 而葉片包被松散的芽 如蒜 麝香石竹和馬鈴薯等 則要用0 1 次氯酸鈉溶液表面消毒10分鐘 這些消毒方法在工作中應(yīng)靈活運(yùn)用 以便適應(yīng)具體的實驗體系 在剖取莖尖時 要把莖芽置于解剖鏡下 一只手用一把細(xì)鑷子將其按住 另一只手用解剖針將葉原基剝掉 解剖針要常常蘸入90 乙醇 并用火焰灼燒以進(jìn)行消毒 當(dāng)形似一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后 用一個鋒利的長柄刀片將分生組織切下來 上面可以帶有葉原基 也可不帶 然后再用同一工具將其接到培養(yǎng)基上 應(yīng)特別注意的是 必須確保所切下來的莖尖外植體不與芽的較老部分或解剖鏡臺或持芽的鑷子接觸 尤其是當(dāng)芽未曾進(jìn)行過表面消毒時更需如此 莖尖長出來的新莖 常常會在原來的培養(yǎng)基上生根 如若不能生根 則需另外采取措施 偶然情況下 在培養(yǎng)基中長出的莖無論經(jīng)過怎樣的處理都不生根 如Morel和Martin 1952 在大麗花中就遇到這種情況 在這種情況下 只有把脫毒的莖嫁接到健康的砧木上 就能得到完整的無毒植株 3 在莖尖培養(yǎng)中影響脫毒效果的因素 培養(yǎng)基 外植體大小和培養(yǎng)條件等因子 會影響離體莖尖再生植株的能力 此外 在培養(yǎng)前或培養(yǎng)期間進(jìn)行的熱處理或化學(xué)處理 也會顯著影響這一方法的效率 外植體的生理發(fā)育時期也與莖尖培養(yǎng)的脫毒效果有關(guān) 1 培養(yǎng)基 通過正確選擇培養(yǎng)基 可以顯著提高獲得完整植株的成功率 影響培養(yǎng)基主要性質(zhì)的是其營養(yǎng)成分 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和物理狀態(tài) 液態(tài) 固態(tài) 莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒所需的培養(yǎng)基包括多種大量元素和微量元素 現(xiàn)在一般使用的是改進(jìn)的MS培養(yǎng)基 裴榮倍對傳統(tǒng)的培養(yǎng)基做了大膽的改進(jìn) 減少了微量元素及有機(jī)成分等十幾種試劑 其繁殖的脫毒苗效果與MS完全培養(yǎng)基基本相同 簡化培養(yǎng)基不僅降低了成本 而且節(jié)省了時間 2 外植體大小 在最適合的培養(yǎng)基條件下 外植體的大小可以決定莖尖的存活率 外植體越大 產(chǎn)生的再生植株的概率也就越高 在木薯中 只有200m長的外植體能夠形成完整的植株 在小的莖尖或是形成愈傷組織 或是只能長根 小外植體對莖的生根也不太有利 當(dāng)然 在考慮外植體的存活率時 應(yīng)該與脫病毒聯(lián)系起來 理想的外植體應(yīng)小到足以能根除病毒 大到能發(fā)育成一個完整的植株 除了外植體的大小之外 葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力 大黃離體頂端分生組織必須帶有2 3個葉原基才能再生成完整植株 Shabde以及smith和Murashign在若干種植物中 雖然證實了不帶葉原基的離體頂端分生組織有可能進(jìn)行無限生長 并發(fā)育成完整的植株 但他們認(rèn)為 葉原基能向分生組織提供生長和分化所必需的生長素和細(xì)胞分裂素 在含有必要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中 離體頂端分生組織能在組織重建過程中迅速形成雙極性軸 根的形成出現(xiàn)于葉原基分化之前 根的發(fā)育是軸向的 而不是縱向的 一旦根莖之間軸建立起來以后 進(jìn)一步的發(fā)育將于種子苗發(fā)育的方式相同 雖然在理論上講 不帶葉原基的頂端分生組織是可能的外植體 但對于脫毒實踐來說 并不可行 正如Murashign所說 如果培養(yǎng)基方法得當(dāng) 用較大的莖尖做外植體 其消除病毒的效果不一定比只用分生組織差 3 培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中 光照培養(yǎng)的效果通常都比暗培養(yǎng)好 Dale在一年生黑麥草中發(fā)現(xiàn) 光照度6000lx培養(yǎng)的莖尖有59 能再生植株 而暗培養(yǎng)的再生率只有34 在馬鈴薯中莖尖培養(yǎng)的最適光照度是1000lx 4周后應(yīng)增加到2000lx 當(dāng)莖已長到1cm高時 光照度還應(yīng)進(jìn)一步增加到4000lx 在進(jìn)行天竺葵莖尖培養(yǎng)的時候 需要有一個完全黑暗的時期 這可能有助于充分減少多酚物質(zhì)的抑制作用 關(guān)于在離體莖尖培養(yǎng)中溫度對植株再生的效應(yīng) 截至目前還未見報道 培養(yǎng)通常都市在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)室溫度下進(jìn)行 4 外植體的生理狀態(tài) 莖尖最好從活躍生長的芽上切去 在麝香石竹和菊花中 培養(yǎng)頂芽莖尖比培養(yǎng)腋芽莖尖效果好 但在草莓中沒有看到這種差別 即使在腋芽比頂芽表現(xiàn)較差的情況下 為了增加脫毒植株的總數(shù)也還是要采用腋芽 這是因為液壓數(shù)目比頂芽多 取牙的時間也是一個影響因子 這對于表現(xiàn)周期性生長習(xí)性的樹木來說更是如此 在溫帶樹種中 植物的生長只限于短暫的春季 此后很長的時間莖尖處于休眠狀態(tài) 直到低溫或光打破休眠為止 在這種情況下 莖尖培養(yǎng)應(yīng)在春季進(jìn)行 若要在休眠期進(jìn)行 則必須采用某種適當(dāng)?shù)奶幚?據(jù)Boxus和quoirin報道 李屬植物取芽之前必須把莖保存在4攝氏度下近6個月 莖尖培養(yǎng)的效率除取決于外植體的存活率和莖的發(fā)育程度外 還取決于莖的生根能力及其脫毒程序 在麝香石竹中雖然冬季培養(yǎng)的莖尖馬鈴薯品種中 在春季和初夏采集的莖尖比在較晚季節(jié)采集的容易生根 三 通過愈傷組織培養(yǎng)消除病毒 在由受感染的組織形成的愈傷組織中 并非所有的細(xì)胞都有該種病原菌 受TMV侵染的煙草愈傷組織 用機(jī)械方法將其分離成單個細(xì)胞后 只有40 帶有這中病毒 由受侵染的愈傷組織能再生出很多不含有TMV的植株 這一事實也證明了愈傷組織中的某些細(xì)胞實際上是不含病毒的 在許多其他植物的莖尖愈傷組織中也已經(jīng)再生出無病毒植株 在受病毒全面侵染的愈傷組織中 某些細(xì)胞之所以不帶有病毒 可能是由于 1 病毒的繁殖速度趕不上細(xì)胞的增值速度 2 有些細(xì)胞通過突變獲得抗病毒的特性 抗病毒侵染的細(xì)胞甚至可能與敏感型細(xì)胞存在與母體組織中 四 脫毒效果的檢驗 盡管我們在切取莖尖時十分小心 并且對他們進(jìn)行了各種有利于消除病毒的處理 也只有一部分外植體能夠產(chǎn)生無病毒植株 因此 對于每一個由莖尖或愈傷組織產(chǎn)生的植株 把他們用作母株以產(chǎn)生無病毒原種之前 必須針對特定的病毒進(jìn)行檢驗 再通過培養(yǎng)產(chǎn)生的植物中 很多病毒具有一個滯后的復(fù)蘇期 因此在頭18個月必須對植株進(jìn)行若干次檢驗 只有那些始終表現(xiàn)陰性結(jié)果的個體 才能說是已經(jīng)通過了對某種或某些特定病毒的檢驗 可以在生產(chǎn)上推廣使用 由于經(jīng)過病毒檢驗的植株有可能重新感染 因而在繁殖過程的各個階段還必須進(jìn)行重復(fù)檢驗 確定在植物組織中是否有病毒存在最簡單的方法 是檢驗葉和莖是否有該種病毒所特有的可見癥狀 不過 由于可見癥狀可能要經(jīng)過相當(dāng)長的時間才能在寄主植物上表現(xiàn)出來 因此需要有更敏感的檢驗方法 植物的葉汁轉(zhuǎn)染發(fā)是用于檢驗病毒的所有方法中最為敏感的方法 進(jìn)行病毒檢驗的接種方法具體如下 由受檢植株上取下葉片 置于等容積的緩沖液中 用研缽和研桿將葉片研碎 在指示植物的葉片上撒上少許600目金剛砂 然后用受檢植物的葉汁輕輕涂于其上 適當(dāng)用力摩擦 以使指示植物葉表面受到侵染 但又不要損傷葉片 大約5分鐘后 用水輕輕洗去葉片上的殘余汁液 把接過種的指示植物放在氣閉溫室或防蛀罩內(nèi) 株間以及與其他植物間都要隔開一定距離 一般需要6 8天或幾周 指示植物即可表現(xiàn)癥狀 植物檢驗是否存在病毒的其他方法 還有血清測驗法和電鏡觀察法 應(yīng)用這兩種方法能很快獲得結(jié)果 但需要專門的技術(shù)和比較昂貴的設(shè)施 血清法和電鏡法通常都要與汁液感染發(fā)同時使用 而不是完全取代汁液感染法 但對不表現(xiàn)可見癥狀的潛伏病毒來說 血清法和電鏡法時必須的選擇 近幾年來發(fā)展起來的PCR技術(shù)為快速可靠的檢測病毒提供了行之有效的手段 對那些已知其核苷酸序列的病毒 可以人為的合成特異引物 通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速檢測病毒存在與否 有關(guān)PCR的具體做法詳見本書其他章節(jié) 但是 對那些尚未掌握其堿基序列的病毒還的采用前述的其他方法進(jìn)行檢測 五 無毒原種的保存與繁殖 利用無毒植株并不具有額外的抗病性 他們有可能很快又被重新感染 為了解決這個問題 應(yīng)將無毒原種種在溫室或防蟲罩內(nèi)滅過菌的土壤中 在大規(guī)模繁殖這些植物的時候 應(yīng)把他們種在田間隔離區(qū)內(nèi) 使植物在該區(qū)域很少或完全沒有感染的機(jī)會 另外一種更容易也是更經(jīng)濟(jì)的方法 是把由莖尖得到的并已經(jīng)過脫毒檢驗的植物通過離體培養(yǎng)進(jìn)行繁殖和保存 六 通過莖尖培養(yǎng)消除病毒的注意事項 要想得到和繁殖一個品種的脫毒植株 首先必須了解有關(guān)該種植株的一些背景知識 特別是可能周身侵染該種植物的病原菌以及這種植物的繁殖方法等 然后應(yīng)當(dāng)檢查實驗植物是否攜帶所疑有的病原菌 并確定莖尖外植體的適當(dāng)大小 確定生長最快并能最大限度消除病毒的培養(yǎng)條件 最后要反復(fù)檢查莖尖產(chǎn)生的植株是否還帶著疑有的病原 并在杜絕任何可能再侵染的條件下 繁殖那些確已脫毒的植株 第三節(jié)植物離體快速繁殖 一 離體快速繁殖的概念與研究進(jìn)展離體快速繁殖是指在無菌條件下 利用植物體的一部分在人工控制的營養(yǎng)和環(huán)境條件下進(jìn)行植物繁殖的一種方法 由于其繁殖速率快 稱之為 快 速 繁 殖 或 擴(kuò)繁 又由于其所用材料細(xì)小 稱之為 微 型 繁 殖 實際上是一種特殊的營養(yǎng)繁殖方法 是植物扦插繁殖方法的擴(kuò)展和延伸 所不同的是扦插繁殖系數(shù)低 只能得到1個從母體上發(fā)根的完整植株 而離體快繁只要建立起組織培養(yǎng)快速繁殖體系 材料將按幾何級數(shù)增殖 增殖系數(shù)因植物種類有差異 多在5 10之間 而且由于組織培養(yǎng)環(huán)境幾乎恒定 因此可進(jìn)行周年生產(chǎn) 一般1年內(nèi)由6個左右的增殖周期 加之組織培養(yǎng)環(huán)境 養(yǎng)分等繁殖條件差異較小 苗木生長具有較好的一致性 繁殖苗木還具有較好的商品性 植物快繁的器官形成方式 1 不定芽型2 器官型3 器官發(fā)生型4 類胚體發(fā)生型5 原球莖發(fā)生型 1 不定芽型 不定芽型 誘導(dǎo)頂端分生組織產(chǎn)生不定芽 再生成植株的方式特點 以芽繁芽 繁殖速度快 后代遺傳性比較穩(wěn)定 2 器官型 器官型 從器官外植體誘導(dǎo)不定芽 再生出植株的方式 特點 直接從器官上誘導(dǎo)不定芽 遺傳性比較穩(wěn)定 但繁殖速度慢 3 器官發(fā)生型 器官發(fā)生型 從器官外植體誘導(dǎo)愈傷組織 經(jīng)愈傷組織細(xì)胞的分化再生成植株的方式 特點 繁殖速度快 由于經(jīng)過愈傷組織而再生成植株 遺傳性不穩(wěn)定 4 類胚體發(fā)生型 類胚體發(fā)生型 由植物細(xì)胞 組織或器官直接誘導(dǎo)發(fā)生胚狀體結(jié)構(gòu) 最終發(fā)育成苗的方式特點 遺傳性穩(wěn)定 但繁殖數(shù)量不如不定芽和器官發(fā)生型多 5 原球莖型 原球莖型 種子消毒后 在培養(yǎng)基上播種 經(jīng)一段時間培養(yǎng)而發(fā)生原球莖 帶芽 然后由原球莖直接長成植株 蘭屬特有的器官發(fā)生方式 蘭花的萌發(fā) 蘭花的啟動 蘭花的增殖 蘭花的分化 培養(yǎng)的蘭花 二 離體快速繁殖商業(yè)性生產(chǎn)的范圍及應(yīng)用 通過離體快速繁殖能生產(chǎn)種苗的植物種類很多 但大部分植物因一些關(guān)鍵技術(shù)尚未突破 繁殖系數(shù)較低 成本過高以及市場需求不大等而未能進(jìn)行規(guī)?；蜕虡I(yè)化生產(chǎn) 目前離體快速繁殖在生產(chǎn)中的應(yīng)用主要有以下幾個方面 1 用于稀缺或急需良種植物的繁殖 一些新選育或新引進(jìn)的良種由于生產(chǎn)上需求的苗木多而急 用常規(guī)繁殖速度慢 短時間內(nèi)無法滿足 因此多嘗試用離體快速繁殖方法來解決 這方面已有火炬松 香蕉 桉樹 楊樹 棗樹 葡萄 山葡萄 杜鵑 櫻桃 除蟲菊 非洲菊 月季 蘋果 甘蔗 馬鈴薯 枸杞 木薯 甘薯 香石竹 大丁草 苧麻及其他果樹及砧木等植物的相關(guān)報道 我國采用離體快速繁殖技術(shù)解決生產(chǎn)問題取得了較大的成功 如廣西建立了我國第一個年產(chǎn)甘蔗試管苗300萬株的工廠 使原需要10年才能擴(kuò)大繁殖用于生產(chǎn)的良種縮短為2年 2 用于莖尖脫毒及無病毒苗木試管快速繁殖 利用莖尖培養(yǎng)或熱處理后再培養(yǎng) 經(jīng)檢測無病毒后再用試管加快繁殖 可獲得大量無病毒苗木 這是消除植物病毒病最有效的方法 也是試管繁殖用于生產(chǎn)最有成效的又一個方面 在國外 40 80 草莓是通過試管脫毒后繁殖的 我國每年生產(chǎn)各類脫毒試管苗達(dá)1000萬株 經(jīng)濟(jì)和社會效益都十分顯著 3 用于自然界無法用種子繁殖或難以保持后代一致的三倍體 單倍體及基因工程植株的快速繁殖 如超雄性石刁柏是我試管繁殖 4 瀕臨植物的拯救 一些珍稀植物或瀕臨 瀕危滅絕植物 數(shù)量極少 若不加以保護(hù)及擴(kuò)大繁殖 就有絕滅的可能 通過試管保存及擴(kuò)大繁殖 則可以避免滅絕 例如 成都生物研究所成功地運(yùn)用試管繁殖珍稀植物猀欏 現(xiàn)已在峨眉山建立起人工猀欏林 5 用于種質(zhì)的試管保存及交換 利用試管保存植物種質(zhì)資源 具有體積小 保存數(shù)量多 條件可控制 避免病蟲害再度污染 節(jié)省人力和土地以及便于國家和地區(qū)間的轉(zhuǎn)移和交換等特點 近10多年來 該項技術(shù)有了長足的進(jìn)步 可用低溫和超低溫方法保存種質(zhì) 這是一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑 特別是對于一些無性繁殖的植物和脫毒品種 市場一旦需要即可大量繁殖 德國許多植物組織培養(yǎng)室成為種質(zhì)保存和繁育中心 國際馬鈴薯中心專門負(fù)責(zé)馬鈴薯種質(zhì)的試管保持及國際交換 三 離體快速繁殖體系的建立 1 無菌培養(yǎng)系的建立任何植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)體系的建立 都必須選用適宜的外植體 所謂外植體 就是第一次接種用的植物材料 雖然幾乎任何植物組織或器官均可作外植體 但具體采用何種組織或器官因培養(yǎng)體系的目的和接種的植物種類的不同而有所不同 通常木本植物 較大的草本植物以莖段比較適宜 能在培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下萌發(fā)出側(cè)芽 成為進(jìn)一步繁殖的材料 一些草本植物比較容易繁殖 或本身短小或缺乏顯著的莖 也可采用葉片 葉柄 花萼 花瓣等作為外植體 外植體選擇好后 到田間或盆栽植物中選取潔凈 無病蟲害的植株 剪去比較幼嫩部分 生長能力較強(qiáng)的部位 樣品采得后 保持其新鮮 迅速帶回 在流水中沖洗1 2個小時 然后在超凈操作臺上用0 5 的升汞或其他表面消毒劑消毒 用無菌水沖洗3 4遍后 接種于滅菌的培養(yǎng)基上 如果外植體污染率小或沒有污染 獲得了無菌材料 并繼代培養(yǎng) 能連續(xù)生長繁殖下去 那么無菌培養(yǎng)系就已經(jīng)建立 2 誘導(dǎo)外植體生長與分化 1 頂芽和腋芽的發(fā)育 頂芽和腋芽在離體培養(yǎng)中都可被誘導(dǎo)而發(fā)育 單個芽可萌生出單一的小苗或多個小苗 在一些園藝品種中 有些獨特的性狀是由病毒硬氣的引起的 這些病毒對寄主植物的健康并無強(qiáng)烈的影響 但如果采取莖尖培養(yǎng)就可能脫除病毒或減低其濃度 使具有觀賞價值的性狀丟失 2 不定芽的發(fā)育 這一植株再生方式由White于1943年在培養(yǎng)煙草愈傷組織時發(fā)現(xiàn) 不定芽的發(fā)生有一個從外植體上產(chǎn)生愈傷組織的階段 這一階段的長短和愈傷組織生長的程度 在不同植物種類和培養(yǎng)條件而有極大地差異 有的愈傷組織生長極為旺盛 使外植體失去原有輪廓 以后芽就從新形成的愈傷組織分化出來 而另一種情況 植物可能僅僅生長一點愈傷組織或幾乎不生長愈傷組織 不定芽就從外植體表面受傷的或沒有受傷的部位直接分化出來 如球根秋海棠 非洲紫羅蘭 百合 等 從觀賞園藝育苗的要求來說 應(yīng)盡快出苗 減少愈傷組織發(fā)生 以免在長期的培養(yǎng)過程中細(xì)胞分裂不正常 失去觀賞價值或失去再生成苗的能力等 植物的許多器官都可以作為誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的外植體 如莖段 葉 葉柄 根 花莖 萼片 花瓣等 3 細(xì)胞胚胎狀體的發(fā)生與發(fā)育 體細(xì)胞的發(fā)育途徑類似 但不同于合子胚 它通過球形 心形 魚雷形和子葉形的胚胎時期 最后發(fā)育成完整的小植株 通過體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生途徑 進(jìn)行無性系的大量繁殖具有極大地潛力 其特點是 成苗數(shù)量多 速度快 結(jié)構(gòu)完整 若干種高等植物的胚狀體成苗途徑已作了形態(tài)發(fā)生學(xué)上的證明 目前 包括裸子植 雙子葉 單子葉植物中的許多科的代表植物 如五針?biāo)?