使用oligo 6和primer premier 5.0等軟件設(shè)計(jì)pcr引物.doc

使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等軟件設(shè)計(jì)PCR引物張新宇（中國(guó)醫(yī)科院腫瘤研究所，北京100021）電子郵件: 在當(dāng)今分子生物學(xué)研究中，PCR技術(shù)已成為使用最多，最廣泛的技術(shù)之一。而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。在PCR擴(kuò)增以前，一般模板序列已被全部或部分確定。要想擴(kuò)增出理想的目的片斷，一般都得通過正確設(shè)計(jì)PCR引物。也有的人不經(jīng)過設(shè)計(jì)直接取模板序列的兩個(gè)片段作為引物，這樣很可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，如擴(kuò)增出多條帶（引發(fā)錯(cuò)配所致），不出目的帶或出目的帶很弱（引物引發(fā)效率低下），引物二聚體帶（引物與引物之間形成穩(wěn)定二聚體）等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。生物信息學(xué)發(fā)展至今日，具有引物設(shè)計(jì)功能的軟件有很多，其中大部分是免費(fèi)軟件，可直接從網(wǎng)上下載，安裝并運(yùn)行。這類軟件大都簡(jiǎn)單易用，但其引物設(shè)計(jì)功能一般不很強(qiáng)，通過它們?cè)O(shè)計(jì)的引物常常不盡如人意，而專門進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的商業(yè)版軟件功能強(qiáng)大，但使用起來(lái)不太容易。本文就這一問題進(jìn)行探討。引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)有幾條基本原則：首先引物要跟模板緊密結(jié)合，其次引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，再次引物不能在別的非目的位點(diǎn)引起DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。圍繞這幾條基本原則，設(shè)計(jì)引物需要考慮諸多因素，如引物長(zhǎng)度（primer length），產(chǎn)物長(zhǎng)度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，G值(internal stability)，引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin），錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)（false priming site），引物及產(chǎn)物GC含量（composition），有時(shí)還要對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制酶切點(diǎn)，引進(jìn)突變等。以使用Oligo軟件分析設(shè)計(jì)引物為例，筆者總結(jié)出以下的要點(diǎn)：1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，即Taq酶的最適溫度。2. 引物3端的序列要比5端重要。引物3端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR影響不大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。3. 引物的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。4. 引物所對(duì)應(yīng)模板序列的Tm值最好在72左右。5. G值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對(duì)較低，且不要超過9（G值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。6. 可能的錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯(cuò)誤引發(fā)率高，錯(cuò)誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100，如此可保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR正常反應(yīng)不能進(jìn)行，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3端的連續(xù)GGG或CCC會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。8. 對(duì)引物的修飾一般是增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)參考載體的限制酶識(shí)別序列確定，常常對(duì)上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識(shí)別序列，以有利于以后的工作。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件較差，比如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；有時(shí)PCR產(chǎn)物要作為克隆對(duì)象插入到載體中表達(dá)，因此PCR引物設(shè)計(jì)的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時(shí)，使用自動(dòng)搜索引物及正確地評(píng)價(jià)引物可使研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)心中有數(shù)。引物的自動(dòng)搜索和評(píng)價(jià)分析帶有引物設(shè)計(jì)功能的軟件有很多，大都是For Windows版本的。在此特別推薦兩個(gè)專門性的引物設(shè)計(jì)軟件（商業(yè)版）：Primer Premier 5（以下簡(jiǎn)稱Premier） 和 Oligo 5.0/6.22軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以O(shè)ligo 軟件最優(yōu)秀；其次是引物的自動(dòng)搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同，因此自動(dòng)搜索的結(jié)果也不盡相同。據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，自動(dòng)搜索功能以Premier 為最強(qiáng)且方便易用，Oligo軟件其次，其他軟件如Vector NTI Suit, Dnasis, Omiga, Dnastar都帶有引物自動(dòng)搜索功能，但搜索結(jié)果不是十分理想。當(dāng)然要想保證得到效果理想的引物，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上，還要對(duì)引物輔以人工分析，以得到最佳設(shè)計(jì)的引物。因此，筆者認(rèn)為引物設(shè)計(jì)軟件的最佳搭配是Oligo 和Premier 軟件一起，以Premier進(jìn)行自動(dòng)搜索，Oligo進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。筆者曾以此搭配給多人設(shè)計(jì)引物，速度又快效果又好。Primer Premier 5.0的使用技巧1.功能簡(jiǎn)介Premier的主要功能分四大塊，其中有三種功能較常用，即引物設(shè)計(jì)()，限制酶切點(diǎn)分析()，基元查找()。另個(gè)功能是同源性分析（），并非Premier的特長(zhǎng)，在此略過。該軟件還有別的一些功能，如序列”朗讀”，DNA與蛋白序列的互換（），發(fā)聲提示鍵盤輸入（）等，但其中最優(yōu)秀的卻是能設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。簡(jiǎn)并引物的出現(xiàn)是出于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平設(shè)計(jì)引物。眾所周知，大多數(shù)氨基酸（二十種常見結(jié)構(gòu)氨基酸中的十八種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA序列時(shí)，就遇到部分堿基的不確定性。這種不確定性因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的，甚至植物線粒體與無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體以及無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體的遺傳密碼都不盡相同。Premier可以針對(duì)各種不同的遺傳密碼規(guī)律設(shè)定不同的DNA和氨基酸的相互轉(zhuǎn)換，這取決于被分析序列的出處。這樣設(shè)計(jì)出來(lái)的引物實(shí)際上是多種序列的混和物，在某些位點(diǎn)有所變化，但大部分還是相同的，稱之為簡(jiǎn)并引物。Primier軟件給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear），無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（Invertebrate Mitochondrion），支原體（Mycoplasma），植物線粒體（Plant Mitochondrion），原生動(dòng)物線粒體（Protozoan Mitochondrion），一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard），脊椎動(dòng)物線粒體（Vertebrate Mitochondrion），和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。2. 使用步驟及技巧Premier軟件的起動(dòng)并打開一段序列后，界面如下：其主要功能在主界面上一目了然（按鈕功能如上述）。限制酶切點(diǎn)分析及基元查找功能比較簡(jiǎn)單，點(diǎn)擊該功能按鈕后，選擇相應(yīng)的限制酶或基元（如-10序列，-35序列等），按確定即可。常見的限制酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制酶或基元。進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，點(diǎn)擊按鈕，界面如下：進(jìn)一步點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)search criteria窗口，有多種參數(shù)以調(diào)整。搜索目的（Seach For）有三種選項(xiàng)，PCR引物（PCR Primers），測(cè)序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer）都分別查找(Both)，或者成對(duì)查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible With Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（Search Ranges），引物長(zhǎng)度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數(shù)選擇（Search Parameters）等等。研究人員可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。如果沒有特殊要求，建議使用默認(rèn)設(shè)置。然后按，隨之出現(xiàn)的Search Progress窗口中顯示Search Completed時(shí)，再按，這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標(biāo)都能達(dá)標(biāo)（如下圖）。點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示Peimer Premier主窗口，如圖所示：該圖分三部分，最上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer），錯(cuò)誤引發(fā)情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由變成，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應(yīng)用。有時(shí)需要對(duì)引物進(jìn)行修飾編輯，如在5端加入限制酶切點(diǎn)，可點(diǎn)擊，然后修改引物序列。若要回到搜索結(jié)果中，則點(diǎn)擊按鈕。若要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來(lái)源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至DNA序列即可。當(dāng)然，對(duì)簡(jiǎn)并引物的分析不能象一般引物那樣嚴(yán)格?？傊?，Premier有優(yōu)秀的引物自動(dòng)搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，使用也容易上手，是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的軟件。Oligo 6.22使用技巧1. 功能簡(jiǎn)介在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中，Oligo是最大名鼎鼎的。Oligo的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個(gè)圖：Tm圖和G圖；Oligo 6.22的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè)Frq圖，不知底細(xì)的人當(dāng)然一看就蒙了。其實(shí)Oligo的主要功能集中在Analyze菜單里，只要把它弄懂了，其他的就很簡(jiǎn)單了。Oligo的功能比Premier還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。Oligo 6.22比Oligo 5.0的改進(jìn)有，多序列共用引物設(shè)計(jì)，排除出現(xiàn)頻率高的序列片斷，搜索功能更加強(qiáng)大細(xì)致，改觀了界面等等。使用Oligo自動(dòng)搜索引物也未嘗不可，尤其是6.22版本，引物搜索功能得到大幅提高，但在方便易用上稍不如Premier。2. 使用（以O(shè)ligo 6.22為例）Oligo 5.0的安裝有個(gè)需要注意的地方，安裝程序完畢后需要安裝一種字體，不然堿基顯示不清楚。在軟件安裝目錄（默認(rèn)為C:oligo）的system下，有一個(gè)字體文件，oli.fon。打開控制面板，選”字體”“安裝新字體”，找到該路徑，安裝即可。Oligo 6.22可免去此步驟。起動(dòng)Oligo 6.22并打開一個(gè)序列后，界面如下：圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)為Tm，G，F(xiàn)rq，其中Frq為6.22的新功能，為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了。經(jīng)過Windows/Tile項(xiàng)后的顯示如圖：在設(shè)計(jì)時(shí)，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺得合適，可點(diǎn)擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的G值在5端和中間值比較高，而在3端相對(duì)低（不要超過9如圖：） Tm值曲線以選取72度附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線為Oligo6新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片斷存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用Frq值相對(duì)較低的片斷。當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先需要檢查的是引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。對(duì)于一般的檢測(cè)（非克?。┬訮CR，對(duì)引物位置，產(chǎn)物大小要求較低，應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。檢測(cè)的第二項(xiàng)是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好，一般來(lái)說，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低，這種PCR需要靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。檢測(cè)的第三項(xiàng)為GC含量，以45-55為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果不是在基因組中進(jìn)行PCR，而是一個(gè)特定模板序列，那么最好還進(jìn)行一下False priming site的檢測(cè)。這項(xiàng)檢測(cè)可以看出引物在非目的位點(diǎn)引發(fā)PCR反應(yīng)的可能性。一般在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率以不超過100為好，但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對(duì)引物也是可以接受的。如果引物在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率比較高，PCR結(jié)果就可能出假陽(yáng)性，這當(dāng)然是我們不愿看到的。當(dāng)我們結(jié)束以上四項(xiàng)檢測(cè)，按Alt+P鍵就出來(lái)PCR窗口，其中總結(jié)性地給出該引物的位置，產(chǎn)物大小，Tm值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。關(guān)于Oligo軟件的引物自動(dòng)搜索功能，因?yàn)榕cPrimer Premier 5類似，并且似乎并不比它更好用，在此不再冗述。其實(shí)使用軟件自動(dòng)搜索引物就是讓計(jì)算機(jī)按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數(shù)設(shè)置得當(dāng)將大大提高工作效率。Oligo6.0 的Memory Table功能：The oligo position displayed at the bottom of the Internal Stability window. The individual squares indicate positions on the active sequence. A marked nucleotide appears as a blue square and represents a position in the R1-R3 memory tables. It usually represents the 5-end of the selected positive strand primers (top sequence = R1) and 3-end of the selected negative strand primers (sequence in the middle = R2) in