卵巢惡性上皮性腫瘤中HLA.doc

卵巢惡性上皮性腫瘤中HLA【關鍵詞】 卵巢癌摘 要 目的：探討卵巢癌中HLADR抗原表達和樹突細胞浸潤的情況及其意義。方法：用免疫組化SP法對卵巢惡性上皮性腫瘤(48例)、良性上皮性腫瘤(30例)及正常卵巢(30例)的HLADR抗原表達及樹突細胞浸潤情況進行對照研究。結果：正常卵巢組織中HLADR陰性,卵巢惡性上皮性腫瘤中HLADR表達陽性率為52.08(P0.01)；HLADR表達率與腫瘤分化程度相關(P0.01)，且與預后相關(P0.05)；卵巢惡性上皮性腫瘤中樹突細胞(S100+DC)浸潤顯著增加(P0.001)；S100+DC浸潤與腫瘤間質淋巴細胞浸潤相關(P0.01)；S100+DC浸潤與腫瘤患者預后相關(P0.05)。結論：卵巢惡性上皮性腫瘤中HLADR抗原表達增強，樹突細胞浸潤增加，二者可能是局部抗腫瘤免疫的重要環(huán)節(jié)；HLADR和樹突細胞浸潤數(shù)量可作為提示卵巢癌患者預后的指標。關鍵詞 卵巢癌;預后;HLA抗原/免疫學;S100蛋白;樹突細胞;免疫組織化學XIAO Guohong, CHEN Huizhen,ZHANG Guiqing,ZHENG XiulingSecond Municipal Peoples Hospital,GuangZhou，Guangdong 510150 Abstract Objective:To investigate the clinical and immunological significance of HLADR antigen expression and dendritic cell infiltration in epithelial ovarian cancer. Method: Samples of 108 cases including normal ovarian tissue (n=30),benign (n=30) and malignant epithelial ovarian tumor (n=48) were used in a comparative study. The SP immunohistochemical stain method was used.Result:HLADR antigen positive rate was significantly higher in the malignant group (52.08%) than that in benign group (10%) and in normal group(0%) (P0.01). There was a correlation between the HLADR expression rate and the tumuor differentiation and between HLADR expression and the prognosis. The number of infiltrating dendritic cells (S100+DC) was much higher in malignant(538.17255.01) than that in benign group(345.96226.81) and in normal group (335.15160.32) (P0.01). There was a correlation between the dendritic cell (S100+ DC) infiltration and the intertumour lymphocyte infiltration (P0.01) and the prognosis (P0.05).Conclusion:It was shown that HLADR antigen expression and dendritic cells infiltration in epitherial ovarian cancer increased, which could play a important role in antitumour immunity. The expression of HLADR antigen and the grade of dendritic cells infiltration in epitherial ovarian cancer is the indicator for the prognosis.Key words ovarian cancer;HLADR antigen/immundogy;S100 protein;dendritic cell;prognosis;immunohistochemistry.人類主要組織相容性復合體即HLA(Human Leukcute Antigen),是迄今所發(fā)現(xiàn)的最復雜的基因復合體，它分別表達、類抗原分子，HLADR是類抗原中表達最頻繁的一種。樹突細胞(dendritic cell ,DC)是體內主要的抗原提呈細胞，是T細胞依賴性免疫應答的重要輔助細胞，通常表達S100蛋白，故稱為S100+DC。近年來HLA分子及S100+DC在腫瘤細胞免疫中的作用引起了廣泛關注，一些學者開始研究HLA分子及S100+DC與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系，相關的研究報告已見于胃癌、食道癌、結腸癌等1,2。但尚未見到HLA分子及S100+DC與卵巢癌關系的研究報告。本研究應用免疫組化方法，將卵巢癌與良性上皮性卵巢腫瘤、正常卵巢組織進行對照研究，探討HLADR分子及S100+DC在卵巢癌中的意義。1 材料和方法1.1 標本來源1.1.1 試驗組 收集廣州市第二人民醫(yī)院19901995年間手術切除的上皮性卵巢腫瘤的存檔蠟塊標本，均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定、石蠟包埋。其中惡性腫瘤48例，年齡2570 a，平均48.9 a，所有病例均接受卵巢癌根治術或卵巢癌細胞減滅術。術后給予PC或PAC方案化療8個周期。手術分期采用FIGO標準，所有病例術后均進行隨訪，中途失訪4例，隨訪率為91.77%。1.1.2 對照組 收集同期手術切除的正常卵巢組織的存檔蠟塊標本，共30例。 1.2 主要試劑 一抗系美國Maxim Biotech.Inc.公司生產(chǎn)的即用型單克隆抗體?？故骃P免疫組化試劑盒，系美國Zymed . Lab . Inc 公司生產(chǎn)。以上試劑均購自福州邁新生物技術公司。1.3 方法1.3.1 常規(guī)HE法染色 對所有標本重新切片，常規(guī)HE法染色，由專人閱片，進行病理診斷，并采用微標尺法計數(shù)間質淋巴細胞浸潤；免疫組化染色方法：SP法。1.3.2 對照 用試劑公司提供的陽性對照片作陽性對照；用PBS代替一抗作陰性對照。1.3.3 染色結果判定 HLADR標記陽性細胞的胞膜，胞漿呈棕色，核無著色。HLADR標記分為陽性、陰性兩種結果；S100標記陽性細胞則采用微標尺法計數(shù)陽性細胞的個數(shù)(個mm2)。1.3.4 統(tǒng)計方法 應用SPSS軟件進行2檢驗、t檢驗。2 結果2.1 組織形態(tài)2.1.1 HLADR表達 HLADR陽性表達表現(xiàn)為上皮細胞的細胞膜染成棕色，細胞漿內呈棕色顆粒，細胞核無著色；同一陽性片中，不同區(qū)域的細胞染色強弱不盡相同。2.1.2 S100標記 上皮細胞無著色，間質中可見陽性細胞，細胞膜呈棕色，細胞漿內棕色顆粒，細胞核染成棕色；細胞呈樹枝狀，嵌于腫瘤細胞之間；與腫瘤細胞，間質浸潤淋巴細胞密切接觸。2.2 HLADR在正常卵巢組織，良性上皮腫瘤、惡性上皮性腫瘤中的表達情況 正常卵巢組織中HLADR抗原表達均為陰性，30例良性上皮性腫瘤中陽性率為10%；48例卵巢癌中HLADR陽性率為52.08%，見表1。卵巢癌中HLADR表達率顯著高于良性腫瘤及正常卵巢組織（P0.01）；而良性腫瘤與正常卵巢組織的HLADR表達率則無明顯差別（P0.05）。廣東藥學院學報(ACAD J GCP) 2000，16(4)第4期 肖國宏等：卵巢惡性上皮性腫瘤中HLADR表達及樹突細胞浸潤的意義表1 正常卵巢、卵巢良性、惡性上皮性腫瘤的HLADR表達略2.3 HLADR表達與卵巢癌臨床病理特征的關系 48例卵巢癌中，漿液性23例，內膜樣癌12例，粘液性13例；HLADR表達與各項臨床病理參數(shù)的關系，見表2。統(tǒng)計學分析顯示，不同組織類型、不同分化程度的HLADR表達差異有統(tǒng)計學意義（P0.01），HLADR表達與臨床分期有關（P0.05），而與間質淋巴細胞浸潤無關（P005），見表3。表2 卵巢癌HLADR表達與臨床病理的關系略表3 卵巢癌HLADR表達與間質淋巴細胞浸潤的關系 略2.4 HLADR表達與卵巢癌患者預后的關系 HLADR陽性組和陰性組，3年生存率分別為8062%和65.46%，5年生存率分別為50.73%和35.77%，經(jīng)過生存分析發(fā)現(xiàn)，HLADR表達與卵巢癌患者生存相關，HLADR陽性患者預后較好（Logrank檢驗，P0.05）。2.5 S100+DC在正常卵巢、良性上皮性腫瘤、惡性上皮性腫瘤中的浸潤情況 正常卵巢組織，良性上皮性卵巢腫瘤及卵巢癌中均有S100+DC浸潤，但在卵巢癌中S100+DC浸潤數(shù)量多于正常卵巢及良性腫瘤，差異有非常顯著性意義（P001），而良性腫瘤與正常卵巢組織則無顯著性差異（P0.05）。見表4。表4 S100+DC在正常卵巢及良、惡性腫瘤中的浸潤情況略2.6 卵巢癌S100+DC浸潤與間質淋巴細胞浸潤的關系 卵巢癌間質中淋巴細胞浸潤程度，與S100+DC數(shù)量呈直線相關(P0.005）。2.7 卵巢癌HLADR表達與S100+DC浸潤之間的關系 HLADR陽性組卵巢癌S100+DC浸潤細胞數(shù)為(598.31296.44) mm2,而HLADR陰性組為(469.73198.57) mm2。HLADR陽性組高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。2.8 卵巢癌中S100+DC浸潤與生存時間的關系 以S100+DC浸潤程度將卵巢癌患者分為兩組：S 100+DC400者為低度浸潤，S100+DC400者為高度浸潤；計算生存率，進行生存分析。結果：高度浸潤組3年生存率和5年生存率分別為72.65%和60.73%；低度浸潤組則分別為6313%和49.98%，兩組病人生存期差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），S100+DC高度浸潤組患者預后好于低度浸潤者。2.9 正常卵巢組織，良、惡性卵巢上皮性腫瘤中淋巴細胞浸潤情況 卵巢癌癌周間質淋巴細胞浸潤數(shù)量，較良性腫瘤，正常卵巢組織顯著增多（P0.05），而良性腫瘤與正常卵巢組織的淋巴細胞浸潤則無顯著差異（P0.05）。見表5。表5 正常卵巢及良、惡性卵巢上皮腫瘤中淋巴細胞浸潤情況略 3 討論3.1 HLADR在卵巢腫瘤中的表達及其意義HLADR是HLA類基因所表達的抗原之一。在正常情況下，HLA類抗原僅在少數(shù)特定的細胞中表達，如激活的淋巴細胞，巨噬細胞等，上皮組織中不表達。在臨床研究中，相繼有學者證實，HLA類抗原在腫瘤中出現(xiàn)異常表達。Sumiya等報告HLADR在胃癌中表達率為4242%；楊春康等報告HLADR在結腸癌中表達率為47%；在鼻咽癌、喉癌、乳腺癌等研究中也有報告，,而在卵巢癌中的表達情況尚未見報道。本實驗對正常卵巢組織，卵巢良性、惡性上皮性腫瘤進行HLADR表達的對照研究，發(fā)現(xiàn)HLADR在惡性腫瘤中的表達率高于正常卵巢組織及良性腫瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。關于HLADR在腫瘤中異常表達的原因，目前有兩種理論：HLADR抗原是細胞失分化的標記，HLADR表達是由于細胞轉化過程中，HLA類基因表達與調控發(fā)生改變，而使腫瘤細胞獲得這一表型，它是與惡性表型同時發(fā)生事件。HLADR抗原是腫瘤浸潤淋巴細胞釋放的淋巴因子所誘導產(chǎn)生的，特別是干擾素（INF）和腫瘤壞死因子（INF）。我們的研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌不同的組織類型，不同的分化程度，其HLADR抗原表達率有顯著差別;而HLADR表達與腫瘤間質淋巴細胞浸潤則無相關性。研究結果傾向于支持第一種理論。對于HLADR的表達與腫瘤的預后方面的研究，國外學者在胃癌、喉癌和乳腺癌的研究表明，HLADR的表達與預后存在正相關，。本研究對48例卵巢癌的HLADR表達進行了研究，陽性率為52.08%，經(jīng)過壽命表法生存分析，顯示HLADR陽性組病人預后較陰性組為好（P005）。說明卵巢癌的HLADR表達也與預后呈正相關。3.2 樹突細胞在卵巢癌中的浸潤及意義。樹突細胞是一類形態(tài)不規(guī)則、核大且不規(guī)則、胞質較少、并向周圍發(fā)出突起、呈樹枝狀的細胞。樹突細胞有多種分子標記物，S100蛋白就是間質性樹突細胞最常用的標記分子。樹突細胞是重要的抗原呈遞細胞（Antigen presenting cell,APC），具有強大的抗原呈遞功能，它不僅能有效地呈遞外源性蛋白抗原，而且，對內源性抗原及自身抗原呈遞至T細胞的過程也至關重要。如果抗原刺激信號來自樹突細胞，即使極低含量的抗原也能誘發(fā)T細胞產(chǎn)生免疫應答。因此，樹突細胞在細胞介導的抗腫瘤免疫中起啟動作用，反映機體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤潛能。而機體抗實體腫瘤的免疫反應是以局部細胞免疫為主的。正是因為如此，近年來，樹突細胞在機體抗腫瘤免疫方面的作用引起了廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)S100+DC數(shù)量與腫瘤預后有關79。關于卵巢癌中樹突細胞的研究尚未見報道。我們用免疫組化方法，研究了卵巢上皮性腫瘤中S100+DC的分布并定量檢測S100+DC浸潤數(shù)量及其與預后的關系，研究表明：卵巢惡性上皮性腫瘤中S100+DC浸潤數(shù)量顯著多于正常卵巢組織及卵巢良性上皮腫瘤（P0.01），并且S100+DC浸潤程度與患者預后呈正相關，S100+DC高度浸潤患者的預后較好（P0.05）。說明對卵巢惡性上皮性腫瘤，S100+DC有提示預后的價值。3.3 HLADR表達、S100+DC浸潤與抗腫瘤免疫的關系。在機體的抗腫瘤免疫中，細胞免疫占有極其重要的主導地位。近年來，大量的免疫學實驗研究證實，T細胞不識別游離抗原，只能識別由抗原呈遞細胞提交的被加工過的抗原片段即抗原肽，且這一識別受MHC的約束，有輔佐分子的積極參與，具體的識別模式是在T細胞和抗原遞呈細胞之間形成一個以T細胞受體(TCR)、抗原肽、MHC為主要成分的三元體，即抗原MHCTCR三分子復合結構。這種識別模式，不僅存在了T細胞與APC之間，還存在于T細胞與之殺傷的靶細胞之間，以及與其它免疫細胞之間的信息溝通過程中。這就是MHC限制的機制。其中CD4+ T細胞只能識別MHC類抗原，而CD4+ T細胞對于誘導免疫記憶，產(chǎn)生長期的抗腫瘤免疫是必不可少的?？梢奌LA在抗腫瘤免疫中的重要作用。如前所述，我們的研究證實，HLA類抗原在卵巢上皮性惡性腫瘤中異常的增強表達，從機體抗腫瘤免疫的角度來講，這正好提供了抗腫瘤免疫的分子基礎；而HLA類抗原的表達與患者預后呈正相關，也佐證了腫瘤對宿主的免疫系統(tǒng)具有調節(jié)作用，HLA類抗原的表達對機體抗腫瘤免疫起正反饋調節(jié)，進而對腫瘤的進展起抑制作用。前面已經(jīng)提到，樹突細胞是最有效的抗原遞呈細胞，在細胞介導的抗腫瘤免疫中起啟動作用，反映機體的免疫系統(tǒng)的抗腫瘤潛能。我們的研究顯示，卵巢惡性上皮性腫瘤的間質S100+DC浸潤與HLA類抗原表達呈正相關（P0.05）, 而淋巴細胞浸潤與S100+DC浸潤呈直線相關(P0.05),這與劉思純等在大腸癌的研究結果一致（8）。說明樹突細胞在機體抗腫瘤免疫中起關鍵作用。由此可見，機體抗腫瘤免疫過程，在抗原水平，有保護性抗原HLA類抗原的表達增強；在APC水平，有樹突細胞浸潤增加；在效應水平，有淋巴細胞浸潤的增加。從而，為我們在基因治療的策略提供了思路。參考文獻1Sumiya Ishigami.Prognositic value of HLADR Expression and dendritic cell infiltration in gastric cancerJ. Oncol,1998,55：65.2Tsajitani S,Kakeji Y,Watanabe A,et al.Infiltration of dendritic cells in relation to tumor invasion an