全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳的應(yīng)用資料.ppt

成像毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)的應(yīng)用 翰宇藥業(yè)研發(fā)三部李勇 毛細(xì)管等電聚焦電泳簡(jiǎn)介 毛細(xì)管等電聚焦 capillaryisoelectricfocusing CIEF 是指在毛細(xì)管中進(jìn)行的等電聚焦 CIEF是根據(jù)物質(zhì)的等電點(diǎn) pI 不同而進(jìn)行分離的 采用兩性電解質(zhì)混合物作為載體電解質(zhì) 當(dāng)在用溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)混合溶液充滿的毛細(xì)管兩端加電場(chǎng)時(shí) 帶電的兩性離子和蛋白質(zhì)以不同的速度遷移通過(guò)介質(zhì) 帶正電的向負(fù)極遷移 帶負(fù)電的向正極遷移 當(dāng)它們遷移至pH pI的區(qū)帶時(shí) 靜電荷為零 不再遷移 這個(gè)過(guò)程稱為等電聚焦 CIEF是分析兩性生物分子的強(qiáng)有力工具 具有分離時(shí)間短 分辨率高 進(jìn)樣量少等優(yōu)點(diǎn) 傳統(tǒng)CIEF的遷移方式 利用電滲流 一般采用采用動(dòng)態(tài)涂敷或化學(xué)修飾的毛細(xì)管改變陽(yáng)極或陰極的電解質(zhì)進(jìn)行化學(xué)遷移 即對(duì)蛋白質(zhì)首先進(jìn)行聚焦 然后通過(guò)陽(yáng)極加鹽或采用堿性電解質(zhì) 陽(yáng)極遷移 陰極加鹽或把陰極電解質(zhì)換為酸來(lái)進(jìn)行 陰極遷移 流體動(dòng)力學(xué)方法 一般采用重力或者加氣壓的方式 傳統(tǒng)CIEF的問(wèn)題 傳統(tǒng)的CIEF使用單點(diǎn)檢測(cè)器 即使所有樣品在到達(dá)檢測(cè)器前已經(jīng)完成分離 也要等到所有聚焦區(qū)帶都通過(guò)檢測(cè)器后才能結(jié)束分離檢測(cè) 從形成pH梯度到樣品聚焦完成通常只需要5min 而聚焦區(qū)帶依次通過(guò)檢測(cè)器卻需要10 40min 不僅增加了額外的分析時(shí)間 并且移動(dòng)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致分離譜帶展寬而影響分離度和分辨率 還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀 成像毛細(xì)管等電聚焦優(yōu)勢(shì) 全柱成像檢測(cè) wholecolumnimagingdetection WCID 克服了傳統(tǒng)CIEF的不足 采用一個(gè)動(dòng)態(tài)檢測(cè)器如電荷耦合裝置 CCD 照相機(jī)或光二極管陣列 PDA 對(duì)整個(gè)分離毛細(xì)管柱 5cm或更短 進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè) 整個(gè)毛細(xì)管內(nèi)不同時(shí)間與不同位置上發(fā)生的任何事件均能得到檢測(cè) WCID不僅能對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)的分離分析 還能在分離的同時(shí)提取出有關(guān)動(dòng)態(tài)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 從而獲取多重信息 因此 CIEF WCID技術(shù)在生物樣品的分離分析 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中有著廣泛的應(yīng)用前景 因此CIEF WCID對(duì)比傳統(tǒng)的CIEF優(yōu)勢(shì)在 不需要遷移分析時(shí)間快重復(fù)性好能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控 iCE 280的結(jié)構(gòu)圖 280nmUV cIEFwithoutMobilizationTheiCE280 iCE 280的結(jié)構(gòu)圖 CIEF WCID在抗體方面的應(yīng)用 羧肽酶去除C末端賴氨酸后 繼續(xù)分析其電荷異質(zhì)性 結(jié)果如圖B所示 抗體1主峰后的2個(gè)堿性峰均消失 證明這2個(gè)堿性峰為C末端賴氨酸不均一性所引起 CIEF WCID在抗體方面的應(yīng)用 為判斷末端賴氨酸不均一性對(duì)其電荷異質(zhì)性的貢獻(xiàn) 將抗體2用羧肽酶去除C末端賴氨酸后 分析其電荷異質(zhì)性 結(jié)果如圖B所示 抗體2主峰后的2個(gè)堿性峰均消失 證明這2個(gè)堿性峰為C末端賴氨酸不均一性所引起 但是經(jīng)羧肽酶B酶切后 其主峰前仍有2個(gè)比例較高的酸性峰 為判斷唾液酸修飾對(duì)其電荷異質(zhì)性的貢獻(xiàn) 將羧肽酶酶切后的抗體2繼續(xù)用N 糖苷酶酶切 分析其電荷異質(zhì)性 結(jié)果圖C所示 經(jīng)過(guò)2個(gè)酶切處理后 抗體2的圖譜基本上只剩1個(gè)主峰 證明抗體2的電荷異質(zhì)性主要是有C末端賴氨酸的不均一性和唾液酸修飾所引起 CIEF WCID在抗體方面的應(yīng)用 由于單抗的分子量巨大 在生產(chǎn)及儲(chǔ)存過(guò)程中可產(chǎn)生大量的修飾 如糖基化 N末端的焦谷氨酸化 C末端的賴氨酸截除 氧化 脫酰胺等等 理論上這些異質(zhì)性的組合可使單抗分子產(chǎn)生約10 8種異構(gòu)體 這些異構(gòu)體的組合形成了單抗的大小異質(zhì)性 電荷異質(zhì)性和糖基化修飾的異質(zhì)性等 電荷異質(zhì)性其堿性峰來(lái)源于C末端賴氨酸的不均一性 甲硫氨酸氧化 天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎《啺返?其中主要為C末端賴氨酸的不均一性 酸性峰則來(lái)源于N 糖末端的唾液酸化修飾 氨基酸殘基的脫酰胺等 由于單抗制品高度復(fù)雜的異質(zhì)性 其質(zhì)控需要組合多種理化分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè) 對(duì)于電荷異質(zhì)性分析 成像毛細(xì)管等電聚焦電泳為對(duì)其進(jìn)行分析提供了一個(gè)快速 靈敏 高分離度的選擇 對(duì)保證單抗類生物技術(shù)藥物生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性及控制其質(zhì)量和提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均具有重要意義 CIEF WCID分析糖蛋白的電荷異質(zhì)性 CIEF WCID分析重組人促紅素 rhEPO 尿素摩爾濃度的選擇 CIEF WCID分析糖蛋白的電荷異質(zhì)性 CIEF WCID分析重組人促紅素 rhEPO 兩性電解質(zhì)的選擇 CIEF WCID分析糖蛋白的電荷異質(zhì)性 CIEF WCID對(duì)重組人促紅素 rhEPO 的異構(gòu)體和等電點(diǎn)進(jìn)行了分析對(duì)聚焦時(shí)間的考察 能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控 CIEF WCID分析糖蛋白的電荷異質(zhì)性 CIEF WCID分析重組人促紅素 rhEPO 很多含唾液酸殘基的糖蛋白類生物制品一樣 rhEPO樣品是由不同的異構(gòu)體組成的 由于糖鏈分支頂端的唾液酸殘基的差異 使得rhEPO的帶電性發(fā)生改變 重組人促紅素因糖基化的差異產(chǎn)生多種異構(gòu)體 每種異構(gòu)體對(duì)生物學(xué)活性貢獻(xiàn)不同 如何有效控制各種異構(gòu)體的含量成為重組人促紅素生產(chǎn)的關(guān)鍵 而rhEPO質(zhì)量控制是確保各種異構(gòu)體的含量達(dá)到一定的比例 由于沒(méi)有一種穩(wěn)定 重復(fù)性好的分析技術(shù)和儀器 異構(gòu)體差異無(wú)法準(zhǔn)確定量 rhEPO質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不完善 無(wú)法完全保證藥品的質(zhì)量和產(chǎn)品的均一性 而成像毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)為分析糖基化的差異產(chǎn)生的多種異構(gòu)體提供了可能 為重組人促紅素質(zhì)量控制提供了有效手段 CIEF WCID在PEG修飾蛋白藥物中的應(yīng)用 PEG化藥物關(guān)鍵質(zhì)量控制難點(diǎn)聚乙二醇的平均修飾率 一個(gè)蛋白分子上平均修飾幾個(gè)PEG分子 修飾均一度 單修飾物位置異構(gòu)體含量百分比 對(duì)單一修飾而言 不同修飾個(gè)數(shù)PEG修飾成份的含量百分比 對(duì)隨機(jī)多位點(diǎn)修飾而言 PEG修飾位點(diǎn)確認(rèn) 板狀電泳分析PEG蛋白 SDS PEG分子量偏離遷移速度變慢模糊連片的條帶甚至找不到條帶 IEF分離pI值偏離遷移速度變慢模糊連片的條帶甚至找不到條帶 PEG長(zhǎng)鏈與電泳凝膠的相互作用 PEG本身對(duì)電荷的屏蔽PEG蛋白的泳動(dòng)會(huì)比蛋白慢很多 電泳完成時(shí)間難以確定 平板IEF分析PEG修飾蛋白 PEG修飾的尿酸氧化酶 HPLC方法 困難 因?yàn)镻EG化 樣品在色譜柱上保留和洗脫行為發(fā)生偏離 現(xiàn)象 1 矮胖峰2 不出峰3 出峰行為反常PEG支鏈影響樣品分子難以進(jìn)入填料小孔PEG改變了分子的疏水性 PEG鏈與色譜介質(zhì)的相互作用 相同分子量下前者比后者的水化體積高兩倍 GPC的保留時(shí)間并不直接與PEG修飾后引起的分子量增加相關(guān)PEG對(duì)蛋白的包裹作用 干擾蛋白電荷和離子交互介質(zhì)帶電基團(tuán)的作用 HPLC方法 蛋白PEG往往導(dǎo)致電荷的變化 PEG蛋白或多肽在PEG化工程中 很多的連接方法是peg連接在帶電荷的側(cè)鏈基團(tuán)或末端基團(tuán)上 比如氨基 上 因?yàn)镻EG常常原本帶正電荷的氨基連接 所以每個(gè)帶正電荷的氨基連接了PEG 那么就被屏蔽一個(gè)正電荷 PEG修飾位點(diǎn)解析 在20種構(gòu)成蛋白質(zhì)的常見(jiàn)氨基酸中 只有具有極性的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)才能夠進(jìn)行化學(xué)修飾 常用的反應(yīng)氨基酸包括賴氨酸 半胱氨酸 組氨酸 精氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 絲氨酸 蘇氨酸 酪氨酸 N 端氨基和C 端羧基 蛋白質(zhì)或多肽分子最容易與修飾劑發(fā)生作用的位點(diǎn)是分子表面賴氨酸殘基上的E氨基 屏蔽一個(gè)帶電基團(tuán) 比如氨基 電荷差異反映在pI值上約有0 1 0 3的差異 1個(gè)氨基結(jié)合PEG 2個(gè)氨基結(jié)合PEG 3個(gè)氨基結(jié)合PEG 4個(gè)氨基結(jié)合PEG 5個(gè)氨基結(jié)合PEG 其他形式的PEG結(jié)合方式 導(dǎo)致的電荷變化很小 0 01 0 05左右 比如結(jié)合在同一個(gè)氨基上的不同長(zhǎng)度不同方式的PEG結(jié)合 屏蔽 同一數(shù)量的氨基 但結(jié)合位置不同上述兩種方式的組合PEG結(jié)合在蛋白的其他非帶電基團(tuán)上 比如半胱氨酸的巰基 電荷變化很小 0 01 0 05左右 難以分成獨(dú)立的峰 使原有的峰變寬 PEG蛋白使得原來(lái)的蛋白峰更寬 CIEF WCID分析PEG修飾的尿酸氧化酶 PEG大多修飾在蛋白表面的賴氨酸上 減少了蛋白表面的正電荷 往往蛋白結(jié)合的PEG數(shù)量越多 帶正電荷就越少 蛋白的等電點(diǎn)降低得越多 CIEF分析結(jié)果 ExPASy 等蛋白分析軟件分析原型蛋白在去除不同修飾位置處的賴氨酸后得到的等電點(diǎn) 將兩者進(jìn)行等電點(diǎn)結(jié)果比對(duì)后 可對(duì)其不同修飾個(gè)數(shù)的PEG UOX峰進(jìn)行歸屬 某細(xì)胞因子及其PEG化的iCE 280結(jié)果 PEG化工藝 專一性 的不同