醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗ppt課件

醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗 國家食品藥品監(jiān)督管理局北京醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 用于檢查要求無菌的醫(yī)療器械是否無菌的一種方法 若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定 僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染 無菌試驗的目的 將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培養(yǎng)基內(nèi) 以檢驗供試品是否有細菌和真菌污染 什么是無菌檢查法 醫(yī)療器械無菌檢驗標準 GB T14233 2 2005醫(yī)用輸液 輸血 注射器具檢驗方法第2部分 生物學(xué)試驗方法2010年版 中國藥典 無菌檢查法 醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南 2010版 無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過程中的一項重要內(nèi)容 其檢驗方法 檢驗結(jié)果判定及檢驗人員業(yè)務(wù)能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全 作為無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè) 其無菌檢驗工作應(yīng)由本企業(yè)獨立完成 并要求企業(yè)的檢驗人員能當場操作或口述無菌檢驗的過程 培養(yǎng)基 是人工配制的生物營養(yǎng)物質(zhì) 即用人工的方法將多種物質(zhì)按各種微生物生長繁殖的需要配成的一種混合營養(yǎng)物 微生物 必須用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的微小生物 微生物具有一定的形態(tài)與結(jié)構(gòu) 并能在適宜的環(huán)境中迅速地生長和繁殖 如細菌 病毒 真菌等 無菌 是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物 凡能殺滅物體中所有活的微生物的作用稱為滅菌 細菌 為單細胞微生物 其細胞分化不完善 無完整細胞核及核膜 核仁 直徑一般為1 m 10 m 真菌 為多細胞或單細胞微生物 其細胞分化完善 有細胞核和各種細胞器 故易在體外生長繁殖 直徑一般為10 m 100 m 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 超凈工作臺 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱 至少2臺 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 壓力蒸汽滅菌器 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 電熱干燥箱 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 集菌儀 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 生物安全柜 從試驗安全性考慮 建議陽性對照試驗使用生物安全柜 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 電子天平 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 光學(xué)顯微鏡 醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備 過濾裝置 無油真空泵 濾杯 濾頭 濾瓶 微孔濾膜 夾子 無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行 其全過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作 防止微生物污染 防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出 單向流空氣區(qū) 工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室 區(qū) 懸浮粒子 浮游菌和沉降菌的測試方法 的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證 隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證 其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求 無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識 并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn) 還應(yīng)該具有高度的責(zé)任心和嚴謹細致的工作作風(fēng) 環(huán)境及人員要求 無菌檢查法環(huán)境要求 隔離系統(tǒng) 無菌檢查法環(huán)境要求 無菌室在消毒處理完畢后 應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù) 無菌檢查法環(huán)境要求 TSA瓊脂平皿在30 35 培養(yǎng)48h證明無菌 取3只放無菌操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋 暴露30min后蓋好 3只培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)平均應(yīng)不超過1個 無菌試驗過程中也應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù) 方法要求同上 無菌檢查法試驗前準備 器具滅菌 與供試液接觸的所有器具應(yīng)采用可靠方法滅菌 置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121 30min 或置電熱干燥箱內(nèi)160 2h 培養(yǎng)基 可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基 亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基 應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2 25 一般在3周內(nèi)使用 無菌檢查法試驗前準備 配制培養(yǎng)基所需器具 無菌檢查法試驗前準備 常用器具與稀釋液 無菌檢查法試驗前準備 培養(yǎng)基 無菌檢查法試驗前準備 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 在供試品接種前 培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1 5 否則 須經(jīng)100 水浴加熱至粉紅色消失 不超過20分鐘 迅速冷卻 只限加熱一次 并應(yīng)防止被污染 其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層 粉紅色 不超過培養(yǎng)基深度的1 2 30 35 培養(yǎng)14天 需氧菌生長 厭氧菌生長 無菌檢查法試驗前準備 培養(yǎng)基 無菌檢查法試驗前準備 改良馬丁培養(yǎng)基 23 28 培養(yǎng)14天 無菌檢查法試驗前準備 培養(yǎng)基 無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求 無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機不少于5支 瓶 培養(yǎng)14天 應(yīng)無菌生長 培養(yǎng)基的適用性檢查 靈敏度檢查 菌種培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代 并采用適宜的菌種保藏技術(shù) 以保證試驗菌株的生物學(xué)特性 金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus CMCC B 26003 銅綠假單胞菌 Pseudomonasaeruginosa CMCC B 10104 枯草芽孢桿菌 Bacillussubtilis CMCC B 63501 生孢梭菌 Clostridiumsporogenes CMCC B 64941 白色念珠菌 Candidaalbicans CMCC F 98001 黑曲霉 Aspergillusniger CMCC F 98003 培養(yǎng)基的適用性檢查 培養(yǎng)基應(yīng)符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求 檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行 靈敏度檢查所用菌種 藥典2010版規(guī)定 金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉 分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 將培養(yǎng)物用0 9 無菌氯化鈉溶液制成菌懸液 濃度小于100cfu mL 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 12mL 9支 分別接種小于100cfu的金葡 銅綠 枯草 生孢各2支 另一支不接種做空白對照 培養(yǎng)3天 改良馬丁培養(yǎng)基 9mL 5支 分別接種小于100cfu的白念 黑曲霉各2支 另1支不接種做空白對照 培養(yǎng)5天 逐日觀察結(jié)果 空白對照管應(yīng)無菌生長 若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好 則靈敏度符合規(guī)定 無菌檢驗有兩種方法 直接接種法 薄膜過濾法直接接種法 將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng) 薄膜過濾法 含抗菌 抑菌成分的供試品會抑制某些微生物的生長繁殖 所以用常規(guī)方法檢查會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果 但并不等于產(chǎn)品中沒有微生物甚至是致病性微生物 所以采用薄膜過濾法來去除供試品中可溶的抑菌性成分 把細菌等微生物截留在濾膜上 然后再經(jīng)過處理培養(yǎng)使所含微生物生長繁殖 從而使微生物檢出 方法驗證試驗 當建立產(chǎn)品的無菌檢查法時 應(yīng)進行方法的驗證 以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查 若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時 檢查方法應(yīng)重新驗證 驗證時 按 供試品的無菌檢查 的規(guī)定及下列要求進行操作 對每一試驗菌應(yīng)逐一進行驗證 方法驗證試驗 菌種及菌液制備 除大腸埃希菌 Escherichiacoli CMCC B 44102 外 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查 大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌 方法驗證試驗與靈敏度檢驗所有菌種區(qū)別 大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌 方法驗證試驗 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾 沖洗 在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌 過濾 取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中 或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi) 另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器 加入等量試驗菌 作為對照 按規(guī)定溫度培養(yǎng)3天 5天 各試驗菌同法操作 方法驗證試驗 薄膜過濾法 方法驗證所用菌種 藥典2010版規(guī)定 金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉 分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物至相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 將培養(yǎng)物用0 9 無菌氯化鈉溶液制成菌懸液 濃度小于100cfu mL 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支 分別接種小于100cfu的金葡 大腸 枯草 生孢各2支 其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量 另1管作為對照 培養(yǎng)3天 改良馬丁培養(yǎng)基4支 分別接種小于100cfu的白念 黑曲霉各2支 其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量 另1管作為對照 培養(yǎng)5天 方法驗證試驗 直接接種法 與對照管比較 如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好 則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計 照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查 如含供試品的任一容器中微生物生長微弱 緩慢或不生長 則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用 可采用增加沖洗量 或增加培養(yǎng)基的用量 或使用中和劑或更換濾膜品種等方法 消除供試品的抑菌作用 并重新進行方法驗證 方法驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行 方法驗證試驗 結(jié)果判斷 供試品包裝須完好無損 尤其是只有一層包裝的樣品 進入無菌檢驗室的樣品若有兩層 或兩層以上 包裝的 需將外包裝在傳遞窗 或緩沖間 拆除后 傳入實驗室 操作人員準備 帶口罩 帽子 穿專用無菌服 鞋進入無菌室 供試品的無菌檢查 供試品的無菌檢查 在100級超凈臺內(nèi) 酒精燈火焰周圍 以無菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 不少于15ml 管 和改良馬丁培養(yǎng)基 不少于10ml 管 的容器中 正確的無菌操作 既不能引入外來菌污染培養(yǎng)物造成假陽性 也要注意接觸供試品的試驗用具溫度不可過高以免將可能存在的菌燙死 陰性對照 目的是驗證試驗是否存在污染 供試品無菌檢查時 應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液同法操作 作為陰性對照 陰性對照不得有菌生長 陽性對照 目的是驗證試驗可靠性 防止假陰性 應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌 無抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌 陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗 加菌量小于100cfu 供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量 陽性對照管培養(yǎng)48 72小時應(yīng)生長良好 供試品的無菌檢查 無菌檢查法 直接接種法 供試品數(shù)量 同一批號3個 11個單位供試品優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng) 如 棉簽 導(dǎo)尿包中的導(dǎo)尿管 注射器中的液體等 無菌檢查法 薄膜過濾法 2010年版 中國藥典 規(guī)定 只要供試品性狀允許 應(yīng)采用薄膜過濾法 供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同 在蠕動泵的作用下 被測產(chǎn)品通過裝有帶空氣過濾器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中 免去了通常膜轉(zhuǎn)移過程中易產(chǎn)生的污染 無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0 45 m 直徑約為50mm 水溶液供試品 取規(guī)定量的供試液 直接過濾 或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi) 混勻 立即過濾 供試液經(jīng)薄膜過濾后 若需要用沖洗液沖洗濾膜 每張濾膜每次沖洗量為100ml 總沖洗量不得超過1000mL 以免濾膜上微生物受損傷 無菌檢查法 薄膜過濾法 沖洗后分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi) 培養(yǎng) 無菌檢查法培養(yǎng)及觀察 上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天 培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長 如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中 培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁 培養(yǎng)14天后 不能從外觀上判斷有無微生物生長 可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中 細菌培養(yǎng)2天 真菌培養(yǎng)3天 觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁 或取培養(yǎng)液涂片 染色 鏡檢 判斷是否有菌 若供試品管均澄清 或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長 判供試品符合規(guī)定 若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長 判供試品不符合規(guī)定 除非能充分證明試驗結(jié)果無效 即生長的微生物非供試品所含 試驗若經(jīng)確認無效 應(yīng)重試 重試時 重新取同量供試品 依法檢查 若無菌生長 判供試品符合規(guī)定 若有菌生長 判供試品不符合規(guī)定 陽性對照管應(yīng)生長良好 陰性對照不得有菌生長 否則 試驗無效 無菌檢查法結(jié)果判斷 當符合下列至少一個條件時 方可判試驗結(jié)果無效 1 無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求 2 回顧無菌試驗過程 發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素 3 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后 確證是因無菌試驗中所使用的物品和 或 無菌操作技術(shù)不當引起的 無菌檢查法結(jié)果判斷 試驗若經(jīng)確認無效 應(yīng)重試 重試時 重新取同量供試品 依法檢查 若無菌生長 判供試品符合規(guī)定 若有菌生長 判供試品不符合規(guī)定 無菌檢查法結(jié)果判斷 醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南 2010版 由于無菌檢驗時間跨度較長 因此過程的記錄應(yīng)能夠完整體現(xiàn)試驗的全過程 對于在試驗過程中出現(xiàn)的各種情況 均應(yīng)在記錄中客觀反映 直接接種法試驗結(jié)果 薄膜過濾法試驗結(jié)果 無菌檢查法判定 試驗報告中宜給出下列信息 供試品名稱 生產(chǎn)批號和 或 滅菌批號 供試液制備方法 接種方式 每日觀察結(jié)果 包括陰 陽性對照 結(jié)果判定 試驗報告 GB15979 2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準 初始污染菌的檢驗 初始污染菌 產(chǎn)品消毒 滅菌前的細菌總數(shù) 可判明檢品受細菌污染的程度以及生產(chǎn)單位所用的原料 工具設(shè)備 工藝流程 生產(chǎn)人員的衛(wèi)生狀況 是對檢品進行衛(wèi)生學(xué)評價的綜合依據(jù) 部分一次性使用衛(wèi)生產(chǎn)品微生物學(xué)指標要求 注 致病性化膿菌指綠膿桿菌 金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌 初始污染菌的檢驗 準備 平皿洗凈 烘干 牛皮紙包好滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制 滅菌 步驟 采樣 供試液制備 培養(yǎng) 菌落計數(shù) 在100級凈化條件下用無菌方法打開至少3個包裝 從每個包裝中取樣 準確稱取10g 1g樣品 剪碎后加入200mL無菌生理鹽水中 充分混勻 液體產(chǎn)品用原液直接做樣液 初始污染菌的檢驗 取上清液共接種5個平皿 每個平皿中加入1mL供試液 用冷卻至45 左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 15 20 mL 倒入每個平皿內(nèi)混合均勻 待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置35 2 培養(yǎng)48h后 計算平板上的菌落數(shù) 稀釋度5 細菌菌落總數(shù) 5塊平板上的細菌菌落總數(shù) cfu g或cfu mL 如 取10g樣品入200mL生理鹽水中 則稀釋20倍 當菌落數(shù)在100以內(nèi) 按實有數(shù)報告 大于100時采用二位有效數(shù)字 初始污染菌的檢驗 計數(shù)方法 將平板置菌落計數(shù)器或從平板的背面直接以肉眼用標記筆點計 以投射光襯以暗色背景 仔細觀察 計數(shù) 必要時可以借助于放大鏡 菌落計數(shù)器 菌落特征 形態(tài)特征 常為白色 灰白色或灰色 亦有淡褐色 淡黃色 邊緣整齊或不整齊 表面有光滑 粗糙 皺褶 突起或扁平 大小差異很大 初始污染菌的檢驗 如果樣品菌落總數(shù)超過本標準的規(guī)定 應(yīng)將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測2次 2次結(jié)果平均值都達到本標準的規(guī)定 則判定被檢樣品合格 其中有任何一次結(jié)果平均值超過本標準的規(guī)定 則判定被檢樣品不合格 醫(yī)療器械的無菌和初始污染菌檢驗相關(guān)標準 GB T14233 2 2005醫(yī)用輸液 輸血 注射器具檢驗方法第2部分 生物學(xué)試驗方法2010年版 中國藥典 無菌檢查法GB15979 2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準GB T15980 1995一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標準YY0033 2000無菌醫(yī)療器具生產(chǎn)管理規(guī)范 1 培養(yǎng)基配制記錄 2 滅菌器 天平等儀器的使用記錄 3 培養(yǎng)基無菌性檢查 靈敏度檢查記錄 4 菌種購買 傳代 使用記錄 5 方法學(xué)驗證記錄 6 無菌試驗記錄 7 滅菌物品制作 8 廢棄物處理記錄 9 潔凈間監(jiān)測記錄 醫(yī)療器械無菌檢驗應(yīng)有記錄 一 適用范圍二 檢查內(nèi)容1 選擇的無菌檢驗方法2 檢驗人員資質(zhì)3 現(xiàn)場察看無菌實驗室環(huán)境4 設(shè)備和器具5 管理制度 操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件6 查閱試驗記錄三 其它應(yīng)注意的問題 醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南 2010版 1 培養(yǎng)基制備 2 供試品的無菌檢查 3 培養(yǎng)及觀察 4 結(jié)果判斷 1 樣品記錄 2 滅菌物品制作記錄 3 原始試驗記錄 4 廢棄物處理記錄 醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南 2010版 其它應(yīng)注意的問題還包括 生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性 試驗樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過程和條件的批中選擇 選擇樣品是隨機的 試驗樣品的選擇和處理技術(shù)應(yīng)明確 以免對樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類造成污染和改變 試驗樣品可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品 它們應(yīng)該代表這個生產(chǎn)批的加工程序和條件 用于試驗的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會影響無菌測試的有效性 醫(yī)療器械無菌試驗檢查要點指南 2010版 其它應(yīng)注意的問題還包括 生產(chǎn)企業(yè)對于供試品的選取 轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施 確保試驗結(jié)果的可靠性 選取制作供試品的試驗樣品時 樣品包裝須完好無損 尤其是只有一層包裝的樣品 進入無菌檢驗室的