分子生物學(xué)常用技術(shù)ppt課件

分子生物學(xué)常用技術(shù) 第十七章 分子生物學(xué)常用技術(shù) 凝膠電泳分子雜交聚合酶鏈反應(yīng) PCR 技術(shù)DNA的物理圖譜DNA序列測(cè)定基因芯片 第一節(jié)凝膠電泳 gelelectrophoresis 電泳概念基本原理Q 6 r 遷移率Q 電荷量r 粒子半徑 分子量 介質(zhì)粘度 電泳的用途分離鑒定純度測(cè)定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 一 瓊脂糖凝膠電泳 agarosegelelectrophoresis 分離核酸原理操作要點(diǎn)應(yīng)用范圍 一 分離核酸原理 電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)分子構(gòu)象 1 電荷效應(yīng) 核酸是兩性電解質(zhì)pH 3 5 正電荷pH 8 0 8 3 負(fù)電荷 正極 2 分子篩效應(yīng) 小分子移動(dòng)快 大分子移動(dòng)慢 3 分子構(gòu)象 閉環(huán)超螺旋 線狀DNA 開環(huán)DNA 二 操作要點(diǎn) 支持物凝膠濃度的選擇DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液樣品制備電泳條件DNA電泳染色DNA片段的回收 1 支持物 商品化的瓊脂糖 瓊脂糖種類 2 凝膠濃度的選擇 凝膠的制備 3 DNAmarker DNAmarker DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線 4 電泳緩沖液 Tris 乙酸 TAE pH8 0Tris 硼酸 TBE pH8 0Tris 磷酸 TPE pH8 0 5 樣品制備 上樣緩沖液50 甘油 蔗糖0 5 溴酚藍(lán) 二甲苯青 點(diǎn)樣 6 電泳條件 潛水電泳恒壓電泳低壓 1 2V cm中壓 8 10V cm高壓電泳 幾十V cm溫度 15 25 潛水電泳 7 電泳染色 溴乙錠 ethidiumbromide EB 結(jié)構(gòu)及染色原理染色方法加入凝膠液中電泳結(jié)束后染色 EB染色原理 紫外燈下顯色 8 DNA片段的回收 低熔點(diǎn)瓊脂糖法透析袋電洗脫法 5kb DEAE 纖維素膜法 0 5 5kb 三 應(yīng)用范圍 DNA的分離 純化和鑒定限制性酶切圖譜分析重組體的分離 鑒定雜交分析PCR產(chǎn)物的分離鑒定 瓊脂糖凝膠電泳 二 聚丙烯酰胺凝膠電泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 分離原理操作要點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用范圍 一 分離原理 電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng) PAGE支持物 單體 丙烯酰胺 Acr 交聯(lián)劑 甲叉雙丙烯酰胺 Bis 催化劑 過(guò)硫酸胺 AP 加速劑 N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 聚丙烯酰胺凝膠 二 操作要點(diǎn) 凝膠的分類凝膠濃度的選擇凝膠液的配制凝膠中DNA的檢測(cè)DNA片段的回收 1 凝膠的分類 非變性凝膠 dsDNA變性凝膠 ssDNA尿素甲酰胺SDS 2 凝膠濃度的選擇 3 凝膠液的配制 PAGE裝置 電泳 4 凝膠中DNA的檢測(cè) 溴乙錠染色法銀鹽染色法甲醛還原放射自顯影法 Ag DNA Ag 黑褐色 5 DNA片段的回收 壓碎浸泡法 1kb純度高 回收率低 三 PAGE優(yōu)點(diǎn) 機(jī)械強(qiáng)度好 化學(xué)穩(wěn)定性高分辨率高載樣量大回收的DNA純度高 四 PAGE應(yīng)用范圍 分離 純化和鑒定RNA和小分子DNADNA序列分析PCR產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分析 第二節(jié)分子雜交 分子雜交的基本原理固相支持物探針幾種常用雜交技術(shù) 一 分子雜交的基本原理 核酸的變性和復(fù)性 分子雜交 DNA DNA DNA RNA 雜交條件 靶分子探針雜交袋雜交爐 雜交種類 被檢核酸種類和方法原位雜交斑點(diǎn)雜交Southern雜交Northern雜交Western雜交反應(yīng)介質(zhì)液相雜交固相雜交 二 固相支持物 固相支持物的特性結(jié)合能力強(qiáng)不影響雜交反應(yīng)結(jié)合牢固非特異性吸附少機(jī)械性能良好 固相支持物的種類 硝酸纖維素濾膜 nitrocellulosefiltermembrane 尼龍膜 nylonmembrane 1 硝酸纖維素濾膜 特點(diǎn)吸附ssDNA和RNA雜交信號(hào)本底低不足不適于重復(fù)雜交濾膜較脆不適于電轉(zhuǎn)移印跡法對(duì)DNA小片段 200bp 結(jié)合能力弱 2 尼龍膜 特點(diǎn)結(jié)合能力強(qiáng)可反復(fù)雜交韌性強(qiáng)適于電轉(zhuǎn)移印跡法對(duì)DNA小片段 10bp 結(jié)合能力強(qiáng)不足雜交信號(hào)本底較高 分子生物學(xué)考試 時(shí)間 2005 1 11 晚7 00 9 00 地點(diǎn)9教講演廳 150人 9 2 1 50人 9 2 2 50人 9 3 1 50人 答疑 1 10 9 00 11 30 3 00 5 30 地點(diǎn) 逸夫樓3樓生化實(shí)驗(yàn)室 三 探針 probe 探針的概念探針的類型標(biāo)記物的種類標(biāo)記方法 1 探針的概念 特異結(jié)合和檢測(cè)靶分子的活性物質(zhì)抗原 抗體配體 受體同源DNA RNA 2 探針的類型 基因組DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針蛋白質(zhì)或多肽探針 3 標(biāo)記物的種類 放射性同位素 32P 3H 35S 125I 14C 非放射性標(biāo)記物生物素地高辛熒光素酶 4 核酸探針的放射性標(biāo)記方法 DNA缺口平移標(biāo)記法隨機(jī)引物標(biāo)記法DNA的5 末端標(biāo)記 缺口翻譯 特點(diǎn)均一標(biāo)記制備dsDNA探針 隨機(jī)引物標(biāo)記法 randompriming 隨機(jī)引物6nt含有各種可能的排列順序特點(diǎn)放射比活性 缺口翻譯操作簡(jiǎn)便DNA cDNA探針 DNA的5 末端標(biāo)記 5 endlabeling 堿性磷酸酶 T4多核苷酸激酶標(biāo)記原理制備寡核苷酸探針制備短的DNA RNA探針 DNA的5 末端標(biāo)記 四 Southern雜交 Southernblotting DNAblotting1975年 EdwenSouthern等印跡 blotting 轉(zhuǎn)移blot aspotormark esp ofinkblotting 1 印跡的方法 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 電轉(zhuǎn)移法 真空轉(zhuǎn)移法 2 Southern雜交的步驟 3 Southern雜交的應(yīng)用 基因的定性及定量分析基因的酶切圖譜分析基因突變分析RFLP 五 Northern雜交 RNAblotting步驟總RNA mRNA 變性電泳分離 轉(zhuǎn)移 雜交 放射自顯影 化學(xué)顯色應(yīng)用檢測(cè)組織 細(xì)胞中mRNA的大小 量比較不同組織 細(xì)胞中基因的表達(dá)情況 Northern雜交 六 Western雜交 免疫印跡 immunoblotting SDS PAGE 轉(zhuǎn)移 蛋白 第一抗體 標(biāo)記的第二抗體 探針 檢測(cè)應(yīng)用 蛋白質(zhì)的定性定量分析 免疫印跡 Southern Northern Western 七 原位雜交 insituhybridization 定義種類細(xì)胞內(nèi)原位雜交組織切片原位雜交基本程序細(xì)胞 組織固定 預(yù)雜交 雜交 沖洗 雜交信號(hào)檢測(cè) 分析結(jié)果 組織切片 八 斑點(diǎn)雜交 dothybridization 第三節(jié)PCR技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng) polymerasechainreaction PCR PCR的發(fā)展簡(jiǎn)史PCR的基本原理和步驟PCR的影響因素PCR的種類PCR的應(yīng)用 一 PCR的發(fā)展簡(jiǎn)史 1971年 Korana提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想1985年 Mullis等發(fā)明了PCR技術(shù)1988年 PE Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR儀 二 PCR的基本原理和步驟 基本原理 DNA復(fù)制三個(gè)步驟變性 denaturation 退火 annealing 延伸 extension PCR的原理 PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 10X擴(kuò)增緩沖液 10ul模板DNA 0 1 2ug引物 各0 2 1umol L4種dNTP 各200umol LMg2 1 5mmol LTaqDNA聚合酶 2 5U總體積 100ul 三 PCR的影響因素 模板引物TaqDNA聚合酶4種dNTPMg2 循環(huán)條件 模板 DNARNA cDNA對(duì)模板的純度要求低 引物 長(zhǎng)度 15 30ntG C含量 40 60 堿基的隨機(jī)分布避免引物自身和引物之間的互補(bǔ)引物的3 端引物的5 端引物濃度 0 2 1umol L TaqDNA聚合酶 2 5U 100ul 20 保存最后加 底物 4種dNTP的濃度相等終濃度 200umol L Mg2 濃度 1 5 2 0mmol L過(guò)高 非特異擴(kuò)增過(guò)低 反應(yīng)產(chǎn)物減少 循環(huán)條件 變性溫度和時(shí)間 90 96 30 60s退火溫度和時(shí)間 40 60 30 60sTm 4 G C 2 A T 延伸溫度和時(shí)間70 75 72 1kb 1min 3 4kb 3 4min 10kb 15min循環(huán)次數(shù) 25 35 四 PCR的種類 反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR insituPCR 實(shí)時(shí)PCR realtimePCR 重組PCR recombinantPCR 錨定PCR anchoredPCR 反向PCR inversePCR 原位PCR 原位雜交 PCR程序固定細(xì)胞 組織樣品 PCR前處理 PCR擴(kuò)增 原位雜交及檢測(cè) 實(shí)時(shí)PCR的原理 五 PCR的應(yīng)用 分子生物學(xué)研究臨床醫(yī)學(xué) 分子生物學(xué)研究 基因克隆DNA序列測(cè)定基因的體外定點(diǎn)突變突變分析 PCR SSCP 基因定量 臨床醫(yī)學(xué) 病原體診斷遺傳病的基因診斷腫瘤檢測(cè)法醫(yī)學(xué) 第四節(jié)DNA序列測(cè)定 Sanger雙脫氧鏈終止法 1977 Maxam Gilbert化學(xué)裂解法 1977 Sanger雙脫氧鏈終止法 原理 DNA復(fù)制反應(yīng)條件模板引物dNTP 其中一種帶放射性標(biāo)記 ddNTPDNA聚合酶 DNA的復(fù)制 2 3 雙脫氧核苷酸 ddNTP DNA測(cè)序操作 DNA自動(dòng)測(cè)序 DNA自動(dòng)測(cè)序儀 第六節(jié)生物芯片 Biochip 20世紀(jì)90年代末生物分子之間相互作用的特異性種類細(xì)胞芯片 組織芯片 微生物芯片 基因芯片 蛋白質(zhì)芯片 基因芯片 概念種類應(yīng)用領(lǐng)域表達(dá)譜基因芯片及其檢測(cè)原理應(yīng)用舉例 什么是基因芯片 基因芯片 Genechip DNAchip 又稱為DNA微陣列 DNAMicroarray 是指固定在載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣 具體地說(shuō)就是將大量寡核苷酸或cDNA有序地 高密度地排列在玻璃 硅等固相載體上 基因芯片 芯片的制備 基因芯片