第三節(jié)(2)多肽和蛋白質類藥物生產(chǎn)

重組人干擾素生產(chǎn)工藝,主要內容,干擾素概述基因工程假單胞桿菌的構建與保藏干擾素的發(fā)酵工藝過程干擾素的分離純化工藝過程,1.干擾素概述,干擾素的種類干擾素的理化性質干擾素的生物學活性干擾素的臨床應用干擾素的生產(chǎn)工藝路線,1.1干擾素的種類,概念：（interferon，IFN）干擾素是一種細胞因子，它是機體感染病毒時，宿主細胞通過抗病毒應答反應，而產(chǎn)生的一組結構類似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名稱為Interferon，簡稱IFN。發(fā)現(xiàn)：干擾素是1957年英國科學家Isaccs等發(fā)現(xiàn)的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細胞，結果發(fā)現(xiàn)這些細胞產(chǎn)生了一種可溶性物質，這種物質能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖，因此，他們將這種物質稱為“干擾素”。以后科學家們進一步發(fā)現(xiàn)，機體對入侵的異種核酸（包括病毒）都產(chǎn)生干擾素以進行防御。當機體細胞受到病毒感染時，機體細胞產(chǎn)生干擾素，干擾病毒復制，它是機體抗病毒感染的防御系統(tǒng)。,天然干擾素分類,1.根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類I型干擾素：IFN、IFN、IFN、IFN來源：白細胞、成纖維細胞、病毒感染的組織細胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長免疫調節(jié)(較弱）其中IFN-為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。II型干擾素：干擾素（IFN)來源：活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生功能：免疫調節(jié)提高單核巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原提呈能力增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性抑制TH2細胞形成，下調體液免疫應答趨化作用抗病毒和抗腫瘤作用（次要）2.根據(jù)動物來源確定分類，例如人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。,上市重組干擾素:2a、2b、1b、1b，1992年我國第一個基因工程藥物IFN-1b獲得國家一類新藥證書。研發(fā)中的重組干擾素：IFN，臨床階段,1.2干擾素的理化性質,143-166aa；MW:18-40ku；pI:6.5-7.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維膜、瓊脂和塑料等介質。,型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應不是直接的，而是通過對宿主細胞的作用引起的。對干擾素敏感的細胞表面存在于干擾素受體，核內有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素作用后該基因活化，產(chǎn)生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻譯，并促進病毒mRNA降解。干擾素能提高細胞表面MHC類分子的表達水平，受到病毒感染的細胞表面MHC類分子的增加有助于向Tc細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解。干擾素可增強NK細胞對病毒感染的殺傷能力。,1.3干擾素的生物學活性,正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細胞產(chǎn)生干擾素。,1.3.1廣譜抗病毒活性機制,病毒復制,抑制病毒復制,信號轉導,IFN-a,IFN-誘導蛋白,誘導刺激,胞核,胞核,抗腫瘤作用機制,型干擾素能抑制細胞的DNA合成，減慢細胞的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的作用比對正常細胞的作用強5001000倍。另外，型干擾素也可通過增強機體免疫機制、加強免疫監(jiān)督功能來實現(xiàn)其抗腫瘤效應。,免疫調節(jié)活性機制,免疫調節(jié)作用表現(xiàn)在對宿主免疫細胞活性的影響，如對巨噬細胞、T細胞、B細胞和NK細胞等均有一定作用。對巨噬細胞的作用：IFN可使巨噬細胞表面MHC類分子的表達增加，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細胞表面表達Fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。對淋巴細胞的作用：干擾素對淋巴細胞的作用較為復雜，可受劑量和時間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或將干擾素與抗原同時投入會產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強的效果。在適宜的條件下，IFN對B細胞和CD8+T細胞的分化有促進作用，但不能促進其增殖。IFN能增強TH1細胞的活性，增強細胞免疫功能；但對TH2細胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFN不僅抑制TH2細胞產(chǎn)生IL-4，而且抑制IL-4對B細胞的作用，特別是抑制B細胞生成IgE。對其它細胞的作用：IFN對其他細胞也有廣泛影響：刺激中性粒細胞，增強其吞噬能力；活化NK細胞，增強其細胞毒作用；使某些正常不表達MHC類分子的細胞（如血管內皮細胞、某些上皮細胞和結締組織細胞）表達MHC類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；使靜脈內皮細胞對中性粒細胞的粘附能力更強，且可分化為高內皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細胞。,1.4重組干擾素的臨床應用,廣譜抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFN）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFN）多發(fā)性硬化癥rhuIFN,1.5.干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）,體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFN-n3/Alferon，批準上市產(chǎn)量低：1gIFN，需要3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性,干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）,人源轉化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFN-n1/Wellferon,批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應用。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）,上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）,上市產(chǎn)品：rhuIFN-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格,動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：,干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）,宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFN-2b/安福隆表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質，具有天然分子結構和生物活性工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析,基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝,2.基因工程假單胞桿菌的構建與保藏,基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫的建立與保藏,2.1、基因工程假單胞桿菌菌種建立,第一步：干擾素-2b基因的克隆第二步：表達載體的構建第三步：工程菌的構建,第一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR),制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質粒,轉化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。,第二步：表達載體構建,IFN基因與表達載體連接轉化大腸桿菌篩選陽性克隆獲得序列正確表達載體,第三步：工程菌構建,轉化假單胞桿篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種,2.2基因工程菌的特性,（1）具有宿主菌的特征：細菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學效價不低于2.0109IU/L。,2.3菌種庫的建立與保藏,QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。,3.干擾素-2b的發(fā)酵工藝過程,3.1搖瓶培養(yǎng),取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250r/min，182h檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。,3.2種子罐培養(yǎng),接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30，pH7.0?？刂疲杭壜?lián)調節(jié)通氣量和攪拌轉速DO為30%，34h，OD4.0。檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。,3.3發(fā)酵罐培養(yǎng),接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭壜?lián)調節(jié)通氣量和攪拌轉速。前4h：30，pH7.0，DO為30%。4h后：20，pH6.0，DO為60%，56.5h。終點控制：OD值達9.01.0，5冷卻水快速降溫至15以下。檢測：發(fā)酵液雜菌檢查,3.4菌體收集,連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：20冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質粒結構一致性、質粒穩(wěn)定性。,4干擾素的分離純化工藝過程,4.1、干擾素分離工藝過程4.2、干擾素的純化工藝過程,4.1干擾素-2b分離工藝過程,菌體裂解預處理初級分離,(1)菌體裂解,裂解緩沖液：純化水配制，210（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。破碎20菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。,(2)預處理-沉淀,加絮凝劑聚乙烯亞胺:210，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:210,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。,(3)離心,連續(xù)流離心機：210，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質雜質沉淀：121、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。,（4）初級分離,鹽析:4M硫酸銨，210，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4保存。,4.2、干擾素純化工藝過程,溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝,(1)溶解粗干擾素,配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45m濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至210。檢查:緩沖液的pH值和電導值。溶解：210，勻漿，完全溶解。,(2)沉淀與疏水層析,等電點沉淀（1）：磷酸調節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中除非疏水性蛋白洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。,等電點沉淀（2）：磷酸調節(jié)pH4.5，調節(jié)電導值40ms/cm，210，靜置過夜超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調整溶液pH8.0，電導值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。,(3)陰離子交換層析與濃縮,0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。鹽濃度線性梯度550ms/cm進行洗脫，配合SDS-PAGE收集干擾素峰。濃縮：調整溶液和電導，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。,（4)陽離子交換層析與濃縮,用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度550ms/cm進行洗脫配合SDS-PAGE收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進行。,(5)凝膠過濾層析,洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂上樣，相同緩沖液進行洗脫。合并干擾素部分,(6)無菌過濾分裝,0.22m濾膜過濾干擾素溶液分裝20以下的冰箱中保存。,(7)檢測項目,干擾素鑒別試驗干擾素效價測定蛋白質含量，純度測定，分子量宿主殘余蛋白、殘余DNA干擾素結構鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列其他：熱原，內毒素，殘留抗生素,發(fā)酵法生產(chǎn)白細胞介素,白細胞介素的結構與功能Interleukin，簡稱IL。目前批準上市的有IL-2、IL-6、IL-12等。,IL-2分子量為的糖蛋白，它刺激已被特異性抗原或致絲裂因數(shù)啟動的細胞增殖。重組白介素可用于臨床研究。主要用于腎癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤有效（）。細胞代表個有單核巨噬細胞，和淋巴細胞特征的異原的細胞體。這些細胞似乎對癌細胞有特異作用。此外，細胞（不象細胞）介導殺傷不受的約束。,生產(chǎn)工藝1工藝流程圖,發(fā)酵,制備包涵體,洗滌與裂解,凝膠過濾與復性