核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立與應(yīng)用ppt精選課件

核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立與應(yīng)用,衛(wèi)生部臨檢中心深圳市血液中心血液病毒核酸檢測(cè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,葉賢林,27.04.2020,.,2,核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的建立,人員場(chǎng)地檢測(cè)方法選擇實(shí)施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號(hào)）,27.04.2020,.,3,核酸實(shí)驗(yàn)室人員要求,資質(zhì):經(jīng)過(guò)臨檢中心PCR培訓(xùn)班培訓(xùn)并取得上崗證；通過(guò)血站核酸實(shí)驗(yàn)室崗前培訓(xùn)考試合格。培訓(xùn):無(wú)”核酸”的概念形成,防污染的概念良好工作習(xí)慣的培養(yǎng).報(bào)告的正確發(fā)放.后備人員的培養(yǎng).,27.04.2020,.,4,試劑準(zhǔn)備區(qū),標(biāo)本制備區(qū),擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),樣本離心交接區(qū),報(bào)告發(fā)放區(qū),核酸實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地,27.04.2020,.,5,方法選擇:TMA與PCR,27.04.2020,.,6,TMA的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn),自動(dòng)化程度高,靈敏度高,擴(kuò)增效率高：10n,不能絕對(duì)定量,27.04.2020,.,7,PCR的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn),易于自動(dòng)化,靈敏度高,擴(kuò)增效率高,匯集拆分過(guò)程繁瑣,拆分可減低非反應(yīng)性比率,27.04.2020,.,8,核酸試劑質(zhì)控,試劑的確認(rèn)試劑運(yùn)輸過(guò)程的控制(溫度條件時(shí)限)靈敏度的要求內(nèi)標(biāo)的要求試劑涵蓋的基因型,27.04.2020,.,9,檢測(cè)流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標(biāo)本檢測(cè)流程,27.04.2020,.,10,檢測(cè)流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標(biāo)本檢測(cè)流程,27.04.2020,.,11,檢測(cè)流程(3):平行檢測(cè)流程,樣本清點(diǎn)交接,核酸單份檢測(cè),常規(guī)檢測(cè),合格標(biāo)本,不合格標(biāo)本,陰性標(biāo)本,反應(yīng)性標(biāo)本,合格標(biāo)本發(fā)布結(jié)果,單項(xiàng)目反應(yīng)性,無(wú)反應(yīng)性,陽(yáng)性或可疑結(jié)果淘汰,陽(yáng)性或可疑結(jié)果淘汰,27.04.2020,.,12,標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫(xiě),核酸實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本檢測(cè)流程核酸實(shí)驗(yàn)室崗位職責(zé)核酸實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵試劑管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)本管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評(píng)價(jià)規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室記錄管理制度核酸實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)規(guī)范核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者追蹤規(guī)程核酸實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)急措施,27.04.2020,.,13,標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫(xiě),核酸標(biāo)本離心交接操作規(guī)程核酸標(biāo)本提取及匯集操作規(guī)程(科華)核酸標(biāo)本擴(kuò)增檢測(cè)操作規(guī)程（科華）核酸標(biāo)本全自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）核酸標(biāo)本檢測(cè)報(bào)告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）核酸標(biāo)本檢測(cè)復(fù)檢操作規(guī)程生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程可移動(dòng)紫外線(xiàn)燈標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程低溫高速離心機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程ABI7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,27.04.2020,.,14,核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施,主要的污染源擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)本之間產(chǎn)生的氣溶膠操作人員手衣服,27.04.2020,.,15,核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施,要有獨(dú)立的空氣處理系統(tǒng).各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通實(shí)驗(yàn)室保持合理的通風(fēng)對(duì)各區(qū)內(nèi)的設(shè)備、物料進(jìn)行標(biāo)示，專(zhuān)區(qū)專(zhuān)用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）空氣：試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)試劑陽(yáng)性對(duì)照儲(chǔ)存在標(biāo)本制備區(qū)使用帶濾芯的吸頭,27.04.2020,.,16,核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施,使用外排式的生物安全柜自配試劑應(yīng)分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應(yīng)廢棄使用次氯酸鈉溶液消毒（臺(tái)面、地面）使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）使用紫外線(xiàn)照射（空氣和臺(tái)面）使用無(wú)水乙醇溶液（空氣噴霧）,27.04.2020,.,17,核酸實(shí)驗(yàn)室污染后措施,實(shí)驗(yàn)室污染后，如何處理？通風(fēng)次氯酸鈉溶液（擴(kuò)增區(qū)不宜使用）HCL溶液（吸頭）紫外線(xiàn)（固定、移動(dòng)）酒精噴灑（空氣）應(yīng)設(shè)計(jì)有備用實(shí)驗(yàn)室:如開(kāi)設(shè)獨(dú)立的報(bào)告發(fā)放區(qū)作為備用,27.04.2020,.,18,中心理念：監(jiān)測(cè)全程的實(shí)驗(yàn)過(guò)程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過(guò)程的效率。,血篩核酸檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)的作用,內(nèi)標(biāo)的作用質(zhì)控整個(gè)反應(yīng)。提示假陰性檢測(cè)結(jié)果。監(jiān)控反應(yīng)的外部條件內(nèi)標(biāo)濃度要合適保持適度的內(nèi)標(biāo)失控.(ChiSqIntercept1-4.68521.5659-7.7542-1.61618.950.0028log10(Dose)14.80001.46991.91907.681010.660.0011,應(yīng)用SAS9.0軟件PROBIT分析結(jié)果,27.04.2020,.,22,ProbitAnalysisonDoseProbabilityDose95%FiducialLimits0.509.570175.1203815.551100.5510.631756.0286917.840470.6011.831137.0273720.773340.6513.213168.1239224.640980.7014.844679.3358129.907500.7516.8320510.6994437.369630.8019.3597312.2864148.541110.8522.7890014.2417966.740000.9027.9795316.90417101.074790.9129.4011617.58727111.931570.9231.0275518.34915125.130150.9332.9198819.21204141.541650.9435.1700620.20878162.548510.9537.9247421.39086190.49822,27.04.2020,.,23,27.04.2020,.,24,陽(yáng)性獻(xiàn)血者的追蹤,溝通原則:專(zhuān)業(yè)授權(quán)、人性化、保密、尊敬。溝通方式：電話(huà)、面談溝通技巧：表?yè)P(yáng)和鼓勵(lì)、合理解釋、知情、適當(dāng)?shù)膯?wèn)候,27.04.2020,.,25,獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)不合格解釋,由于核酸檢測(cè)方法目前尚不能排除假陽(yáng)性，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進(jìn)入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測(cè)不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不作為獻(xiàn)血者健康體檢指標(biāo)。更不宜作為疾病診療指標(biāo)。獻(xiàn)血者獻(xiàn)血權(quán)利仍保留。,27.04.2020,.,26,關(guān)于核酸檢測(cè)的解釋,匯集結(jié)果成反應(yīng)性,拆分結(jié)果為陰性.內(nèi)標(biāo)失敗.ELISA(+),核酸結(jié)果為(-)ELISA(-),核酸結(jié)果為(+)核酸單檢結(jié)果反應(yīng)性與血液發(fā)放.化學(xué)發(fā)光法與核酸檢測(cè).,27.04.2020,.,27,1.靈敏度：匯集池大小要滿(mǎn)足靈敏度要求。靈敏度太低，病毒低載量獻(xiàn)血者漏檢。HBVDNA靈敏度宜50拷貝/ml.2.引物是否有效性,能否檢測(cè)亞型和突變株感染。3.假陽(yáng)性，防污染措施（血篩主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率與自動(dòng)化.5.需要規(guī)范化場(chǎng)地和高素質(zhì)的操作人員.6.參加國(guó)際間室間質(zhì)控,提高檢測(cè)水準(zhǔn).,血液核酸篩查注意的問(wèn)題,27.04.2020,.,28,深圳血液中心核酸檢測(cè)概況,對(duì)161228人份酶免疫檢測(cè)結(jié)果陰性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，共檢出33例不相同HBVDNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者，總比率為1：4885。檢出anti-HCV陰性、HCVRNA陽(yáng)性1例，定量結(jié)果為1.2105IU/ml。3個(gè)月后追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。,27.04.2020,.,29,深圳血液中心核酸檢測(cè)概況,27.04.2020,.,30,HBVDNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者追蹤情況,對(duì)17位HBVDNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行了追蹤，9位獻(xiàn)血者發(fā)生血清轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。4例呈窗口期特征（或部分），2例獻(xiàn)血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象1例獻(xiàn)血者原為乙肝大三陽(yáng)患者，經(jīng)治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰后，獻(xiàn)血，常規(guī)檢測(cè)為合格，核酸檢測(cè)HBVDNA（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛?yáng)性,27.04.2020,.,31,27.04.2020,.,32,27.04.2020,.,33,27.04.2020,.,34,27.04.2020,.,35,27.04.2020,.,36,HBVDNA檢測(cè)陽(yáng)性獻(xiàn)血者追蹤概況,27.04.2020,.,37,1號(hào)獻(xiàn)血者在追蹤時(shí)表明曾經(jīng)是大三陽(yáng),治療轉(zhuǎn)陰后獻(xiàn)血,被核酸檢出陽(yáng)性,7天后HBsAg檢測(cè)(+).,27.04.2020,.,38,27.04.2020,.,39,1.PoolingbySTARprocessor,2.Virusenrichmentbycentrfugation,3.ExtractedbyKHB-1000,4.AmplifiedanddetectedbyABI7300,27.04.2020,.,40,27.04.2020,.,41,1.poolingandextractionbySTARLET,2.Am