第七章 核酸分子雜交技術(shù)與核酸序列測定

.,第七章核酸分子雜交技術(shù)與核酸序列測定MolecularHybridizationandBlottingTechnology主講教師：熊偉副教授/博士,.,ContentofTable,前言1核酸分子雜交技術(shù)的原理2核酸探針的制備3核酸探針的標(biāo)記4核酸分子雜交技術(shù),.,前言,.,核酸分子雜交把親源關(guān)系較近的，不同生物個體來源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。,.,第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理,.,（一）核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。,一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理P44,.,復(fù)性,RNA,DNA,.,1.原理DNA的變性與復(fù)性2.常見條件：加熱S形曲線解鏈溫度（Tm）A260增高的原因3.分子雜交的目的,.,應(yīng)用：(1)檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。,Home,.,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,.,例：變性引起紫外吸收值的改變,DNA的紫外吸收光譜,增色效應(yīng)：DNA變性時其溶液A260增高的現(xiàn)象。,.,熱變性,解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。,.,Tm：變性是在一個相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。,.,DNA的復(fù)性與分子雜交,DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。,熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。,復(fù)性條件：Tm50C4度以下幾乎不復(fù)性,.,.,核酸分子雜交的應(yīng)用研究DNA分子中某一種基因的位置鑒定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ),.,第二節(jié)核酸探針技術(shù)及其標(biāo)記,探針(probe)P46經(jīng)過特殊標(biāo)記的核酸片段，具有特定的序列，能夠與待測的核酸片段互補(bǔ)結(jié)合，因此可用于檢測核酸樣品中的特定基因。,.,一、核酸探針的種類和應(yīng)用,根據(jù)核酸性質(zhì)和檢測目的不同可以分為：（一）基因組DNA探針（二）cDNA探針（三）RNA探針（四）人工合成的寡核苷酸探針最基本的原則是核酸探針與要檢測的核酸之間在核酸序列上要有高度的特異性,.,基因組DNA探針,真核生物基因組中存在大量的重復(fù)序列和非編碼序列，因此選擇基因組DNA做探針時，一定要充分考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康男岳梅肿涌寺』騊CR方法可以獲得某一段特定的DNA序列,.,cDNA探針,cDNA是能與mRNA互補(bǔ)的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的。利用基因克隆的方法可獲得cDNA優(yōu)點(diǎn)：cDNA探針不含有內(nèi)含子序列，尤其適用于基因表達(dá)的檢測。,.,RNA探針,RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針。利用mRNA與基因的DNA雜交，可以反映出基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。,.,人工合成的寡核苷酸探針,利用DNA合成儀，采用化學(xué)方法人工合成寡核苷酸探針,.,設(shè)計(jì)寡核苷酸探針的原則,1）序列及長度根據(jù)靶分子的序列而定，長度一般為18-50個核苷酸合適。2）堿基成分一般G+C含量為40%-60%3）探針分子內(nèi)不存在互補(bǔ)，避免出現(xiàn)“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)4）避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)，不超過4個5）與非靶標(biāo)區(qū)域的同源性不超過70%,.,二、探針的標(biāo)記,探針標(biāo)記方法:放射性和非放射性兩種放射性核素：32P、35S和3H非放射性標(biāo)記物：1）半抗原：生物素、地高辛素抗原-抗體反應(yīng)2）配體：生物素-親和素反應(yīng)3）熒光素(FITC、羅丹明)4）化學(xué)發(fā)光探針,.,探針標(biāo)記方法,核酸分子雜交所用的探針幾乎都用體外標(biāo)記法標(biāo)記，分為化學(xué)法和酶法化學(xué)法P48：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)直接將標(biāo)記物結(jié)合到探針分子上。特點(diǎn)是簡單、快速、均勻。酶法P48：將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子滲入到探針分子上去，或?qū)⒑塑账岱肿由系臉?biāo)記基團(tuán)交換到探針分子上。,.,一個理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足：(1)標(biāo)記前后探針基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;(2)特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；(3)操作簡單、節(jié)時；(4)安全、無環(huán)境污染。,.,常用探針的標(biāo)記方法,3.2.1缺口平移法3.2.2隨機(jī)引物標(biāo)記法3.2.3末端標(biāo)記法3.2.4生物素光照標(biāo)記法,.,缺口平移法的原理,將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的53的聚合酶活性和53的外切酶活性相結(jié)合。首先用E.coli的DNAseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNApolI的53外切酶活性，切去帶有5-磷酸的核苷酸；同時利用該酶53聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。這兩種活性同時作用，缺口不斷向3方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。,.,隨機(jī)引物標(biāo)記法原理,用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對原則不斷在其3-OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。,.,末端標(biāo)記法原理,（1）一種是在5末端加成標(biāo)記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP的-磷酸轉(zhuǎn)移加到DNA片段5-OH上。（2）在探針3-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個單標(biāo)記的-32PdNTP。,.,生物素光照標(biāo)記法,光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)加成反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。,.,探針的純化,1.乙醇沉淀法用無水乙醇沉淀2-3次2.SG-50柱層析法3.微柱離心法,.,第三節(jié)核酸分子雜交的基本方法,核酸分子雜交根據(jù)被分析樣品的性質(zhì)不同，分為：液相雜交和固相雜交。固相雜交：液相中的核酸探針與位于固相支持物上的待測核酸片段進(jìn)行雜交的過程。分為：原位雜交印跡雜交,.,印跡雜交將通過凝膠電泳分離的核酸片段轉(zhuǎn)移到特定的固相支持物上,在轉(zhuǎn)移過程中，核酸片段保持其原來的相對位置不變，然后采用標(biāo)記的核酸探針與結(jié)合于固相支持物上核酸片段進(jìn)行雜交的技術(shù)。,.,印跡雜交類別：（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting),.,二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用,（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。,從組織或細(xì)胞中提取基因組DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳將DNA按大小分離含有DNA區(qū)帶的凝膠在變性溶液中變性DNA變性后從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上特異性探針與固著于膜上的DNA雜交雜交結(jié)果反映待測核酸樣品的有關(guān)基因信息。,.,分子雜交實(shí)驗(yàn),.,白瓷盤,玻璃板,濾紙,凝膠,尼龍膜,濾紙,吸水紙,玻璃板,重物,吸水紙轉(zhuǎn)膜,.,。,.,真空轉(zhuǎn)膜,.,.,.,Southern印跡法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,瓊脂糖電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,與放射性標(biāo)記DNA探針雜交,放射自顯影,帶有DNA片段的凝膠,凝膠,濾膜,用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA,吸附有DNA片段的膜,.,Southern和Western印跡法,DNAfrangment,Electrophoresis,TransferofDNAbyblotting,32P-labledDNAprobe,Autoradiography,Agarrosegel,Autoradiogram,Nitrocellulosesheet,Autoradiogram,Polymersheet,SDS-Polyacrylamidegel,Transferprotein,Addradiolabledspesficantibody,Washtoremoveunboudantibody,Proteinbanddetectedbyspecificantibody,Autoradiography,.,（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting),基本過程與Southernblotting相似。用于RNA的定性定量分析。,.,（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting),將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。常用Ab來檢測蛋白質(zhì)，也被稱為免疫印跡技術(shù)?？侩娹D(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。,.,實(shí)驗(yàn)操作1細(xì)胞裂解物的準(zhǔn)備；2細(xì)胞裂解物的蛋白定量；3細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE；4蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移；5目的蛋白質(zhì)的檢測。,蛋白質(zhì)免疫印跡法,.,三種印跡技術(shù)的比較,.,.,放射自顯影照片,.,(四)斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交,Dotblottingandslotblotting,適于核酸樣品定量檢測，而不是定性檢測。,.,(五)原位雜交insituhybridization,分為菌落、噬菌斑及真核細(xì)胞原位雜交,.,第三節(jié)核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis,.,基因測序是確定DNA雙股鏈上每個獨(dú)立結(jié)構(gòu)單元或堿基的確切順序的過程。測序經(jīng)常被稱為“破譯”，因?yàn)槠浣Y(jié)果就像解碼一樣。解碼結(jié)果包含數(shù)百頁和成千上萬行4種字母的序列。這些字母表示4種不同的堿基，分別用它們的首字母A、T、C、G表示，其排列順序中蘊(yùn)藏著各種各樣的遺傳信息和生命指令。,生物信息學(xué)(bioinformation)是一門伴隨著基因組研究而產(chǎn)生的交叉學(xué)科。廣義地說，它是從事與基因組研究有關(guān)的生物信息的獲取、加工、儲存、分配、分析和解釋的一門學(xué)科。這個定義包含兩層意思，即對海量數(shù)據(jù)的收集、整理以及對這些數(shù)據(jù)的應(yīng)用。,.,核酸序列分析的基本原理,化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法),DNA鏈的末端合成終止法(sanger法),.,DNA測序的基本戰(zhàn)略,設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測的DNA鏈中的相應(yīng)每個核苷酸處都有斷裂或終止。通過PAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據(jù)長短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測DNA的堿基序列。酶法測序技術(shù)進(jìn)展,.,DNA序列分析（一）雙脫氧終止法英國Sanger1955確定牛胰島素結(jié)構(gòu),1958獲諾貝爾化學(xué)獎1975設(shè)計(jì)出DNA測序法,1980獲諾貝爾化學(xué)獎.合成一段與待測DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。,.,.,.,.,DNA的Sanger測序法(酶法),dNTP,反應(yīng)混合物,Klenow酶,未知序列的單鏈DNA,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,.,DNA的測序儀示意圖,computeranalysis,凝膠中DNA移動方向,樣品槽,激光器,輸入光學(xué)系統(tǒng),成象透鏡,聚焦透鏡,高靈敏度相機(jī),旋光鏡/棱鏡組件,.,測序技術(shù)進(jìn)展同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳,多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳,單色熒光標(biāo)記平板電泳,同位素標(biāo)記平板電泳,A,C,G,T,測序圖譜,TA