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文檔簡介

【目的】：了解底物濃度與酶反應(yīng)速度間的關(guān)系，學(xué)習(xí)求蔗糖酶米氏常數(shù)的方法【原理】：米氏方程式v=米氏常數(shù)的求法很多，最常用的是LineweaverBurk的作圖法(雙倒數(shù)作圖法)。米氏方程式可改寫為下列倒數(shù)形式：選擇不同的s，測定相應(yīng)的v，求出兩者的倒數(shù)，以1/s為橫坐標(biāo)，以1/v為縱坐標(biāo)作圖，繪出一條直線，外推至橫軸相交，橫軸截距即為-1/Km。,蔗糖酶米氏常數(shù)的測定,1,2,3,還原糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑反應(yīng)：,4,【儀器與試劑】1.儀器：分光光度計、恒溫水浴、試管、吸管、秒表、坐標(biāo)紙2試劑標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1mg/mL）3%蔗糖溶液（87.7mM）0.2mol/LNaAc緩沖溶液（pH4.6）0.5mol/LNaOH溶液3,5-二硝基水楊酸試劑,5,【操作步驟】1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定,將各管溶液混合均勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻至室溫，以蒸餾水稀釋至25mL，搖勻。測540nm處A值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。,6,取試管8支編號，按下表將蔗糖溶液，醋酸緩沖液分別加入試管，于37水浴中保溫10min。一定量酶液同一水浴中保溫約10min。于各管中依次按同樣間隔(0.5min)加入已保溫過的酶液1.0mL，計時，立即搖勻，在37中準(zhǔn)確溫浴5min。按同樣次序和時間間隔，加入1mL0.5mol/LNaOH，搖勻，終止反應(yīng)。吸取反應(yīng)物1.0mL，加入盛有3.0mL3，5-二硝基水楊酸試劑和1.0mL水的試管中混勻，放入沸水浴中加熱5min，冷卻后稀釋至25mL，搖勻，在540nm比色測定A值。以A值對應(yīng)的葡萄糖量為相對反應(yīng)速度，以1/S為橫坐標(biāo)，1/v為縱坐標(biāo)作圖，由圖求出Km值。,2底物濃度和初速度測定,7

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