t-DNA鑒定ppt課件

,遺傳學(xué)實驗,模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定,1,二、實驗?zāi)康?提取植物基因組DNA的方法PCR操作方法瓊脂糖凝膠分離核酸方法,2,三、實驗原理,1.Ti質(zhì)粒和T-DNA：,Ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌的天然質(zhì)粒，該質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移進植物細胞，并插入植物染色體DNA中。所以Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的DNA被叫做T-DNA。,3,將Ti質(zhì)粒進行改造，將感興趣的基因放進T-DNA區(qū)段中，通過農(nóng)桿菌侵染植物細胞，實現(xiàn)外源基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化。,4,2.T-DNA插入基因內(nèi)部導(dǎo)致基因突變T-DNA插入到植物染色體上的什么位置，是隨機的。如果T-DNA插入進某個功能基因的內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成基因功能的喪失。所以利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞，是獲得植物突變體的一種重要方法。,5,3.用PCR方法鑒定T-DNA插入純合突變體農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞后，在獲得的后代分離群體中，有T-DNA插入的純合突變體，雜合突變體，和野生型。在突變體研究中，需要的材料是純合突變體，所以必須從分離群體中將純合突變體鑒定出來。,6,利用三個引物做PCR鑒定純合突變體LP和RP是植物基因組上T-DNA插入位點兩測的引物BP是T-DNA區(qū)段上的引物,7,PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：,8,擴增結(jié)果,經(jīng)過PCR，在野生型植株，LP和RP這對引物擴增出分子量較大的產(chǎn)物（大帶）；在雜和突變體，LP和RP能擴增出分子量較大的產(chǎn)物（大帶），另外BP和RP還能擴增出分子量較小的產(chǎn)物（小帶）；在純合突變體，只有BP和RP能擴增出分子量較小的產(chǎn)物（小帶）。,9,10,2*CTAB提取液(PH8.0)2%CTAB1.4MNaCl20MmEDTA(PH8.0)100MmTris-HCl(PH8.0)0.2%巰基乙醇CTAB提取液（1000ml）組成：20gCTAB100ml1MTris-HClpH8.040ml0.5MEDTApH8.081.8gNaCl0.2%(V/V)-巰基乙醇）,11,步驟,1.用液氮將100mg幼嫩葉片研磨成細粉，置于1.5ml離心管中加入預(yù)熱至65的600l的2CTAB提取液，輕搖混勻。2.65水浴30min，其間輕搖混勻。3.向上清液加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），室溫下輕輕混勻10min，12000rpm離心15min，再轉(zhuǎn)移上清入新管。4.向上清液中2倍無水乙醇或等體積的異丙醇，小心混勻，-20下30min，12000rpm離心15min，棄上清。5.用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000rpm稍離心，棄上清。6.將沉淀晾干，加20-50lTE(pH8.0)，65水浴30min溶解DNA。7.瓊脂糖凝膠電泳檢測或用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和質(zhì)量。,12,PCR原理和方法,聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；,13,PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系,DNA模板引物反應(yīng)緩沖液dNTPddH2O耐熱聚合酶,14,反應(yīng)體系對PCR擴增的影響,DNA模板,純度蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性模板降解會導(dǎo)致PCR擴增無產(chǎn)物濃度加量過多導(dǎo)致非特異性擴增增加特異性長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性避免反復(fù)凍融濃度應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則,引物,擴增產(chǎn)物太少,15,引物設(shè)計軟件,PRIMERPREMIER5Oligo6,16,反應(yīng)體系對PCR擴增的影響,反應(yīng)Buffer,pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強劑,Mg2濃度,過高非特異性嚴(yán)重過低無擴增產(chǎn)物,dNTPMixture,濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融,ddH2O,pH值適當(dāng)避免污染,17,如何選擇最合適的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性,純度,穩(wěn)定性,酶活性,18,反應(yīng)體系,H2O10 xTaqbuffer（MgCl2free)MgCl2(25mM)引物L(fēng)P(10uM)引物RP(10uM)引物BP(10uM)dNTP(各2.5mM)模板DNA(30-50ng/l)Taq酶(5U/l),19,反應(yīng)體系（三引物體系）,25ul體系H2O15ul10 xTaqbuffer（MgCl2free)2.5ulMgCl2(25mM)2ul引物L(fēng)P(10uM)1ul引物RP(10uM)1ul引物BP(10uM)1uldNTP(各2.5mM)0.5ul模板DNA(30-50ng/l)2ulTaq酶(5U/l)0.2ul,20,反應(yīng)體系（雙引物體系）,25ul體系H2O16ul10 xTaqbuffer（MgCl2free)2.5ulMgCl2(25mM)2ul引物L(fēng)P或（引物BP）(10uM)1ul引物RP(10uM)1uldNTP(各2.5mM)0.5ul模板DNA(30-50ng/l)2ulTaq酶(5U/l)0.2ul,21,反應(yīng)程序,預(yù)變性945min9440sec5350sec7280sec循環(huán)35次7210min,PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟變性退火延伸,22,LPTCATCCACCATGGAAGAAAAGRPTTGGATACGATGCGAGTAACC中間引物BPTGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用LP+RP產(chǎn)生大帶：1107bp用LBa1+RP產(chǎn)生小帶：560-860bp,23,瓊脂糖凝膠電泳技術(shù),DNA含有PO43-基團，在pH8.0Buffer中帶負電,在電場中向正極移動。自由電泳時，由于不同大小的DNA片段的電荷密度大致相同，各核酸分子難以分開；,24,選用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠作為支持物，使之具備一定的孔徑，即可發(fā)揮分子篩效應(yīng)，使大小不同的核酸片段遷移率出現(xiàn)較大差異，