生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題

生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題第一章 緒論第一節(jié) 生物技術(shù)的發(fā)展史1、生物技術(shù)：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計(jì)構(gòu)建具有與其性狀的新物種或新品系，并與工程結(jié)合，利用這樣的新物種進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會(huì)提供商品服務(wù)的一個(gè)綜合性技術(shù)體系。它的范疇：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程?；蚬こ淌巧锛夹g(shù)的核心。P12、蛋白質(zhì)工程-第二代基因工程；海洋生物技術(shù)-第三代生物技術(shù)P13、生物技術(shù)發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、現(xiàn)代（DNA重組）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重組技術(shù)1975年，Koher 和 Milstein 建立了單克隆抗體技術(shù)1982年，第一個(gè)基因工程藥物重組人胰島素被批準(zhǔn)上市1989年，我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物干擾素批準(zhǔn)上市2003年，中國(guó)的重組腺病毒-p53注射液成為石階上第一個(gè)正式批準(zhǔn)的基因治療藥物。第二節(jié) 生物技術(shù)藥物1、生物技術(shù)制藥：生物技術(shù)制藥：采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。P42、生物技術(shù)藥物：采用DNA重組技術(shù)活其他生物技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。它與天然生化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物制品共同歸為生物藥物。3、現(xiàn)代生物藥物分為4類：重組DNA技術(shù)制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑；基因藥物；天然藥物；合成與部分合成藥物。4、生物藥物按用途分為：治療藥物；預(yù)防藥物；診斷藥物。5、生物技術(shù)藥物的特征：（1）分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜；（2）具有種屬特異性；（3）治療針對(duì)性強(qiáng)、療效高；（4）穩(wěn)定性差（5）基因穩(wěn)定性；（6）免疫原性；（7）體內(nèi)半衰期短；（8）受體效應(yīng)；（9）多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)；（10）檢驗(yàn)的特殊性。第三節(jié) 生物技術(shù)制藥1、生物技術(shù)制藥的特征：高技術(shù)、高投入、長(zhǎng)周期、高風(fēng)險(xiǎn)、高收益。P52、生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用有哪些？P7（1）基因工程制藥： 開(kāi)發(fā)基因工程藥物，如干擾素（IFN）、紅細(xì)胞生成素（EPO）等 基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 基因工程抗體，它可以作為導(dǎo)向藥物的載體 基因診斷與基因治療應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型 應(yīng)用極影工程激活素改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物 改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物。（2）細(xì)胞工程制藥單克隆抗體技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物。（3）酶工程制藥 ：酶與細(xì)胞的固定化及酶轉(zhuǎn)化制藥（4）發(fā)酵工程制藥：發(fā)酵工藝改進(jìn)、新藥研制、菌種改造。第二章 基因工程制藥第一節(jié) 概述（略）第二節(jié) 基因工程藥物的生產(chǎn)過(guò)程P151、基因工程技術(shù)：將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。2、基因工程藥物制造的主要程序 （過(guò)程）（重點(diǎn)和后面幾節(jié)聯(lián)系起來(lái)）（1）目的基因的克?。ǚ蛛x目的基因）：通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、化學(xué)合成方法來(lái)制備cDNA，再通過(guò)核酸探針雜交或免疫反應(yīng)來(lái)篩選目的基因（2）目的基因與載體連接構(gòu)建DNA重組體：通過(guò)限制性內(nèi)切酶DNA連接酶等核酸酶，把目的基因組入載體的相關(guān)克隆位點(diǎn)，常用的載體有質(zhì)粒載體和噬菌體載體（3）將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌：常用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌等，先使宿主菌處于感受態(tài)，再通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式把重組DNA導(dǎo)入宿主菌，以構(gòu)建工程菌（4）工程菌發(fā)酵：提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、反應(yīng)器、控制好發(fā)酵過(guò)程中的各種參數(shù)，如溫度、PH、溶氧等，并通過(guò)升溫來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)（5）目的基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化：通過(guò)固液分離、初步純化、高度純化、成品加工來(lái)制備產(chǎn)品；若是胞內(nèi)產(chǎn)物需要細(xì)胞破碎，若是包涵體則需要變性和復(fù)性（6）產(chǎn)品的檢驗(yàn)：檢測(cè)產(chǎn)品的質(zhì)量和性能 。第三節(jié) 目的基因的獲得1、利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽需要得到其基因，制備目的基因常用的方法有哪些？P16 （1）逆轉(zhuǎn)錄法 以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的到cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，從cDNA文庫(kù)中篩選目的基因。由于RNA轉(zhuǎn)錄加工過(guò)程中，內(nèi)含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文庫(kù)中無(wú)內(nèi)含子，適于在原核系統(tǒng)中表達(dá)。但是，cDNA只包含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因部分，缺少有關(guān)的調(diào)控序列，因此在原核系統(tǒng)中表達(dá)，還需要根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)，配以相應(yīng)的調(diào)控序列。 （2）利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備基因 （3）化學(xué)合成法：只適用于克隆小分子肽的基因 2、利用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過(guò)程P16 （1）mRNA的純化 ：從表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取總RNA，用寡聚脫氧胸苷（dT）纖維素柱從總RNA中提取純化mRNA。 （2）cDNA的合成 ：以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，再用DNA聚合酶合成cDNA的雙鏈。（3）cDNA克?。豪煤线m的連接方法，將產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段插入到合適的載體中。 （4）構(gòu)建cDNA文庫(kù) ：將cDNA與載體連接的重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，產(chǎn)生的克隆群體為cDNA文庫(kù)。 （5）從cDNA文庫(kù)中篩選目的基因 ：得到cDNA文庫(kù)后，通常采用核酸探針雜交法和免疫反應(yīng)鑒定法從數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA片段中篩選出目的基因。3、載體分為：表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體。P17第四節(jié) 基因表達(dá)1、基因表達(dá)：指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。P202、基因高效表達(dá)研究：指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。P203、基因表達(dá)的微生物宿主細(xì)胞分為兩大類：P21第一類為原核細(xì)胞（常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）； 大腸桿菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系）：表達(dá)基因產(chǎn)物形式多樣，大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去?？莶菅堪麠U菌：分泌能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對(duì)產(chǎn)物降解。鏈霉菌：作為外源性基因表達(dá)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。第二類為真核細(xì)胞（常用的真核微生物有酵母、絲狀真菌等） 酵母：酵母菌是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無(wú)毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)絲狀真菌：分泌能力強(qiáng)，能正確進(jìn)行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。4、目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母。P225、大腸桿菌基因表達(dá)載體P23（1）pBV220系統(tǒng)pBV220系統(tǒng)國(guó)內(nèi)使用最多的載體,其組成：來(lái)源于pUC8多克隆位點(diǎn)；核糖體rrnB基因終止信號(hào)；pBR322第42253735位；pUC18第2066680位；噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動(dòng)子；pRC23的PL啟動(dòng)子及SD序列（2）pET系統(tǒng)6、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素P22外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)量取決于：（1）外源基因的劑量 ：一般來(lái)說(shuō)細(xì)菌內(nèi)基因拷貝數(shù)增加，基因的表達(dá)產(chǎn)物也增加。 （2）外源基因的表達(dá)效率 啟動(dòng)子的強(qiáng)弱： 啟動(dòng)子是在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因表達(dá)的因素。需要尋找強(qiáng)的啟動(dòng)子。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性：大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)真核基因在細(xì)菌中的高效表達(dá)是十分重要的。 SD 序列和起始密碼ATG的間距 ：表達(dá)非融合蛋白的關(guān)鍵是原核SD序列和真核起始密碼ATG之間的距離，距離過(guò)長(zhǎng)過(guò)短都影響真核基因的表達(dá)。 密碼子組成：應(yīng)選擇使用大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子。 （3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性： （4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷 ：必須使宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷不至過(guò)重，又能高效表達(dá)出外源基因產(chǎn)物。 （5）工程菌的培養(yǎng)條件 外源基因的高水平表達(dá)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關(guān)系，而且與其所處的環(huán)境條件息息相關(guān)，必須進(jìn)行優(yōu)化。 7、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式P26以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因 以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)； 缺點(diǎn)：只能作抗原用。以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因 非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。 優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性； 缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。分泌型表達(dá)藥物基因（外源基因融合到編碼原核蛋白信號(hào)肽序列的下游） 優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不 含蛋氨酸殘基； 缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高， 信號(hào)肽不被切割。8、載體相關(guān)定義載體：在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子?？寺≥d體：從病毒、質(zhì)?；蚋叩壬锛?xì)胞中獲取的DNA作為載體，在其上插入合適大小的外源DNA片段，將重組后的載體引入到宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中大量繁殖。表達(dá)載體：在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件(如啟動(dòng)子、RBS、終止子等)，是目的基因能夠表達(dá)的載體。穿梭載體：指含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體（例如既能在原核生物中復(fù)制,又能在真核生物中復(fù)制的載體）。9、載體的復(fù)制系列可分四類： P27（1）Yep類（酵母附加體質(zhì)粒）（2）YRp類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）（3）YCp類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（4）YIp類（酵母整合型質(zhì)粒）10、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素外源基因的拷貝數(shù)外源基因的表達(dá)效率：?jiǎn)?dòng)子分泌信號(hào)的效率終止序列的影響外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響：菌體生長(zhǎng)力強(qiáng) 菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定 分泌能力強(qiáng)11、精確表達(dá)載體P28酵母載體有兩類：普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體。精確表達(dá)載體：要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于接入外源基因，并使它在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸的克隆載體。第五節(jié) 基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)1、碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長(zhǎng)。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用；P31第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性1、質(zhì)粒不穩(wěn)定分為那兩類？P32工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。 質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌在分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例的不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。與含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；這兩種菌比數(shù)率差異的大小有關(guān)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變?；?、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法P33（1）選擇合適的宿主菌：遺傳穩(wěn)定（2）選擇合適的載體：高拷貝數(shù)；（3）選擇壓力：如加抗生素提高穩(wěn)定性；（4）分階段控制培養(yǎng)：先使菌體生長(zhǎng)至一定密度；再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá) （5）控制培養(yǎng)條件 （6）固定化第八節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng)1、基因工程菌的培養(yǎng)方式P36（1） 分批培養(yǎng)（2）補(bǔ)料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的方法。（3）連續(xù)培養(yǎng)（4）透析培養(yǎng)（5）固定化培養(yǎng)2、基因工程菌的培養(yǎng)工藝P37（1） 培養(yǎng)基的影響（2） 接種量的影響（3）溫度的影響（4）溶氧量的影響（5）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響（6）誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響：一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。（7） pH的影響：生長(zhǎng)pH在6.87.4左右，后期外源蛋白的表達(dá)其最佳pH為6.06.5。第九節(jié) 高密度發(fā)酵1、什么是高密度發(fā)酵？影響高密度發(fā)酵的因素有哪些？可采取哪些方法實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵？P41（1）高密度發(fā)酵：一個(gè)相對(duì)概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達(dá)200gDCW/L。（2）影響高密度發(fā)酵的因素：培養(yǎng)基；溶氧濃度；pH；溫度；代謝副產(chǎn)物（3）實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法P43發(fā)酵條件的改進(jìn)a.培養(yǎng)基的選擇（普遍采用6g/L的甘油為碳源）；b.建立流加式培養(yǎng)的方式；c.提高供氧能力構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌a.阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑；b.對(duì)碳代謝流進(jìn)行分流；c.限制進(jìn)入糖酵解途徑的碳代謝流；d.引入血紅蛋白基因構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第十節(jié) 基因工程藥物的分離純化1、表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì) ，它的制得具有以下特點(diǎn)：P46（1）表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；（2）含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；（3）表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；（4）表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；（5）對(duì)其質(zhì)量要求純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。2、分離純化的基本過(guò)程若是論述題最好對(duì)過(guò)程進(jìn)行一定的介紹3、建立分離純化工藝的根據(jù)P46（1）含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn)基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過(guò)程的各種因素對(duì)分離、純化工藝有影響。包括：菌種的類型及其代謝特性。原材料培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量。生產(chǎn)工藝及條件。（2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。（3）目的產(chǎn)物特性。（4）產(chǎn)品質(zhì)量的要求4、細(xì)胞破碎與固液分離 細(xì)胞收集： 離心法、膜分離法。 細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法；物理法、化學(xué)法、生物法 固液分離：離心、膜過(guò)濾、雙水相萃取5、細(xì)胞破碎的方法；P47（1）物理方法：勻漿法、珠磨法、超聲波法（2）化學(xué)法：滲透沖擊法（高滲+低滲）、增溶法（表面活性劑等）（3）生物法：酶溶法6、分離純化常用的色譜分離方法有那些？P50分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過(guò)程精制階段的常用手段，其優(yōu)點(diǎn)是該法具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等 有害效應(yīng)。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過(guò)濾色譜、高 壓液相色譜等。 （1）離子交換層析P51離子交換介質(zhì)由三部分構(gòu)成：（1）不溶性高分子聚合物載體；（2）共價(jià)鍵結(jié)合于載體上-活性基團(tuán)或功能集團(tuán)（3）與活性基團(tuán)帶相反電荷-平衡離子或反離子（決定是陰離子交換樹(shù)脂還是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）如：酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂R-SO3H蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分布主要影響離子交換的性能。它由平衡、上樣、洗脫（分為梯度洗脫和階段洗脫2種）、再生4個(gè)主要步驟構(gòu)成。（2）疏水層析P54利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無(wú)機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。流動(dòng)相為pH68鹽水溶液。常用的介質(zhì)是多聚糖（如瓊脂糖）和硅膠。（3）親和層析P4756親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。洗脫時(shí)分為特異性洗脫和非特異性洗脫。（4）凝膠過(guò)濾層析P59凝膠過(guò)濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，大分子量物質(zhì)先流出，小分子物質(zhì)后流出。利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開(kāi)。7、用于分離純化的技術(shù)應(yīng)滿足那些要求？P62(1)技術(shù)條件溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。 (2)選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高純化倍數(shù)。 (3)收率要高。 (4)兩個(gè)技術(shù)之間不需要對(duì)物料加以處理或調(diào)整，這樣可以減少工藝步驟。 (5)整個(gè)分離純化過(guò)程要快速，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。 第十一節(jié) 變性蛋白的復(fù)性1、外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成P632、包涵體：指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。 3、包涵體的分離和溶解P63（1）包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑（脲或鹽酸胍）、去垢劑（Triton X-100）、脫氧膽酸鈉洗滌。（2）包涵體溶解：般用強(qiáng)的變性劑如脲（6-8M）、鹽酸胍（6M），或用去垢劑，如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等，溶解涵體蛋白質(zhì)。 （3）包涵體復(fù)性：稀釋復(fù)性和透析復(fù)性；含二硫鍵的蛋白的復(fù)性；封閉蛋白的疏水蔟促進(jìn)復(fù)性；凝膠過(guò)濾層析復(fù)性；小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性；分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性；人工分子伴侶的復(fù)性第十二節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制1、由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行鑒定時(shí)，常作那些項(xiàng)目分析？P68（1）肽圖分析 肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì)后，對(duì)生成的肽段進(jìn)行的分離分析。它是一種可檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化的最有效方法，該技術(shù)靈敏高效的特點(diǎn)使其成為對(duì)基因工程 藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選方法。 （2）氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含50個(gè)左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是接近理論值的，即與序列分析結(jié)果一致。 （3）部分氨基酸序列分析 部分氨基酸序列分析（N端15個(gè)氨基酸）可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標(biāo)。 （4）重組蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定和分子量測(cè)定蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白質(zhì)分子量測(cè)定最常用的方法有凝膠過(guò)濾法和SDS-PAGE法，凝膠過(guò)濾法是測(cè)定完整的蛋白質(zhì)分子量，而SDS-PAGE法測(cè)定的是蛋白質(zhì)亞基的分子量。（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析 二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，基因工程藥物產(chǎn)品的硫-硫鍵是否正確配對(duì) 是一個(gè)重要問(wèn)題。第三章 動(dòng)物細(xì)胞制藥第一節(jié) 概述細(xì)胞工程：是指以細(xì)胞為對(duì)象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定的細(xì)胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門(mén)綜合性科學(xué)技術(shù)。P79第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)（重點(diǎn)）1、離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分為那些類型？P81 動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)功能,形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類：貼壁細(xì)胞；懸浮細(xì)胞（1）貼壁細(xì)胞 生長(zhǎng)須有貼附的支持物表面， 自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼 附因子才能在該表面上生長(zhǎng)。兩種形態(tài)： 成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型（2）懸浮細(xì)胞： 生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如淋巴細(xì)胞。（3）兼性貼壁細(xì)胞：生長(zhǎng)不嚴(yán)格依賴支持物。如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。2、什么是接觸抑制現(xiàn)象？P84當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，即每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時(shí)， 細(xì)胞就停止增殖。此時(shí)若能保持充足的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活相當(dāng)一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再 增加，所以該現(xiàn)象又稱之謂接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn) 象隨之消失，細(xì)胞可多層生長(zhǎng)。細(xì)胞密度也就可大大增加。 3、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)P83（1）細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 動(dòng)物細(xì)胞分裂所需的時(shí)間一般為1248h，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細(xì)胞其所需的時(shí)間也不同。周期=間期+分裂期 間期（G1+S+G2） 分裂期（M） （2）細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象 (3)正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的 (4)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)各種物理化學(xué)因素，如滲透壓，pH，離子濃度，剪切力，微量元素等的變化耐受力很弱。 (5)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高 氨基酸、維生素，多種無(wú)機(jī)鹽和微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子。 (6)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同 動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成除了在游離的核糖體上進(jìn)行外，還在與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上結(jié)合的核糖 體上進(jìn)行。（游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。）3、動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥物的特點(diǎn)；P85（1）優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品多分泌在胞外，收集純化方便，得到較完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，因此與天然產(chǎn)品更一致，適于臨床（2）缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件要求高，成本貴，產(chǎn)量低第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得1、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的種類及其特點(diǎn)P86用于生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞有三類，即原代細(xì)胞、已建立的二倍體細(xì)胞系、以及可無(wú)限期傳代 的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，以及用這些細(xì)胞進(jìn)行融合和重組的工程細(xì)胞。 (1)原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過(guò)分碎，消化而獲得的細(xì)胞懸液。用得最多的是雞胚細(xì)胞，原代兔腎或鼠腎細(xì)胞，以及血液的淋巴細(xì)胞。 (2)二倍體細(xì)胞系 原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選，并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。該細(xì)胞株仍具備“正?！奔?xì)胞的特點(diǎn)，一般均從動(dòng)物的胚胎組織中獲取。 (3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞 這類細(xì)胞是通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的，它常常由于染色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正?！奔?xì)胞的特點(diǎn)，而獲得了無(wú)限增殖的能力。由于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有無(wú)限生命力，而且常常倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求較低，故更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。 (4)其他：融合細(xì)胞系（物理法如高壓電場(chǎng)和化學(xué)法如仙臺(tái)病毒、聚乙二醇）和重組工程細(xì)胞系2、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建，使用的載體有兩類：（1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒；（2）質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體P883、重組DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的常用方法：融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法，最常用磷酸鈣沉淀法、 電穿孔法P894、生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：原始細(xì)胞庫(kù)（MCB）、生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（MWCB）或工作細(xì)胞庫(kù)（WCB）P91第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基1、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件P92(1)器材的清洗和消毒 器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、沖洗 器材的消毒滅菌: 物理消毒/化學(xué)消毒(2)水質(zhì) :電阻值大于18M,去熱原。(3) pH:7.27.4(4)滲透壓:290300mOsm/kg(5)溫度:哺乳動(dòng)物370.5 C；(6)空氣:氧的飽和質(zhì)60%,氧分壓 40.7kPa2、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成P95動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基大致可以分成三類：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基。 （1）天然培養(yǎng)基：血清、羊水、腹水等,成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定（2）合成培養(yǎng)基：成分明確、大量供應(yīng)，DME、MEM、DMEM等（第一個(gè)合成培養(yǎng)基是199培養(yǎng)基；氨基酸：12種必需氨基酸+谷氨酰胺維生素：形成輔基和輔酶糖類：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺無(wú)機(jī)鹽：維持滲透壓其它成分：核酸前體和氧化還原劑如谷胱甘肽添加5%10%小牛血清：作用是提供生長(zhǎng)因子和激素；提供貼附因子和伸展因子；提供結(jié)合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素（3）無(wú)血清培養(yǎng)基： 無(wú)血清培基的優(yōu)點(diǎn)如下： 提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批間差異的影響。 減少了由血清帶來(lái)病毒、霉菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)。 供應(yīng)充足，穩(wěn)定。 細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。 避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性。 減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。（簡(jiǎn)答題時(shí)候可以不寫(xiě)優(yōu)點(diǎn)） 無(wú)血清培養(yǎng)基加入添加劑：生長(zhǎng)因子和激素（胰島素）；結(jié)合蛋白（鉄傳遞蛋白和白蛋白）；貼附因子和伸展因子（膠原等）；有利細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素（谷胱甘肽）第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法1、細(xì)胞傳代；P101原代培養(yǎng)形成的單層細(xì)胞匯合以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生成空間不足或由于細(xì)胞密度過(guò)大引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，都將影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一程序常稱為傳代或傳代培養(yǎng)。傳代方法：（1）懸浮細(xì)胞：加生長(zhǎng)液，然后分種（2）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)方法和操作方式1、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法P103（1）懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)增殖。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，不但細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細(xì)胞密度一般較低。（目前在生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備主要是通氣攪拌罐式生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器。） 2貼壁培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上，細(xì)胞才能生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法。較容易采用灌流 培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度。但操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。 3貼壁懸浮培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。 包埋和微囊培養(yǎng)：包埋和微囊培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。 包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害；可以獲得較高的細(xì)胞密度；可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。（目前最普遍的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠） 結(jié)團(tuán)培養(yǎng) ：結(jié)團(tuán)培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)是用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法進(jìn)行培養(yǎng)，所以它也是一種貼附懸浮培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便，節(jié)省了微載體的成本。 2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式；P106動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式一般可分為分批式、加料分批或流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌流式。 （1）分批式操作 （一種是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不斷增長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成和積累。最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。另一種是先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度后，往反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時(shí)間作用后，將反應(yīng)物取出。） （2）半連續(xù)式操作 （該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一 段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù) 量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該操作方式在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被 廣泛采用。） （3）灌流式操作 （該方式是當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷地將 部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。它與連續(xù)式操作不同處，在于取出部分 條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時(shí)也取出部分細(xì)胞。） 括號(hào)部分的內(nèi)容重在理解 第七節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器1、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器必需具備的基本要求；P107（1）一切材料，對(duì)細(xì)胞必須無(wú)毒性。（2）具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能。（3）密封性能良好（4）對(duì)多種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測(cè)、調(diào)節(jié)和高精度控制（5）可長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn) （6）容器內(nèi)面光滑，無(wú)死角（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修。設(shè)備成本盡可能低。2、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及特點(diǎn)；P108（1）攪拌罐式生物反應(yīng)器（目前最廣泛應(yīng)用的動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器）：靠攪拌槳提供液相攪拌的動(dòng)力，它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性（2）氣升式生物反應(yīng)器：其特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便。（3）固定床式生物反應(yīng)器：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、裝填材料無(wú)毒且利于細(xì)胞貼壁，剪切力小的特點(diǎn)（4）流化床式生物反應(yīng)器 ：可連續(xù)操作（5）袋式或膜式生物反應(yīng)器：可取出某些有害代謝物（6）中空纖維生物反應(yīng)器：用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，細(xì)胞的密度高，如果控制系統(tǒng)不受污染，能長(zhǎng)期運(yùn)轉(zhuǎn)。3、反應(yīng)器及檢測(cè)；P114（1）溫度檢測(cè)元件：電阻溫度計(jì)；（2）PH：復(fù)合式參比電極（3）溶氧：極普電極或電流式覆膜電極第十節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望1、動(dòng)物細(xì)胞制藥有哪些新進(jìn)展？P135（1）改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量：采用更強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子更好的利用擴(kuò)增系統(tǒng)或?qū)ふ腋弑磉_(dá)位點(diǎn)采用和改造更好的宿主細(xì)胞（2）利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本：采用代謝工程改造工程細(xì)胞改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本（3）抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)周期（4）采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量（5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究（6）組織工程的研究2、代謝工程：采用基因工程的手段，使工程細(xì)胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，使其降低對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，減少某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和無(wú)害，以及控制工程細(xì)胞的增殖速度和制造產(chǎn)品的能力。P137第四章 抗體制藥第一節(jié) 概述P1431、抗體：即Ig，指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。2、1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（McAb）。3、單克隆抗體：將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的特異性完全相同的高純度抗體。 單克隆抗體有缺陷：分子量過(guò)大；鼠源性抗體；所以要改造：降低單克隆抗體的免疫源性和降低其相對(duì)分子量。P144第二節(jié) 單克隆抗體及其制備（重點(diǎn)）1、克隆化：指單個(gè)細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。P1482、什么是單克隆抗體？它是如何制備的？P144（1）抗原與動(dòng)物免疫制備高純度抗原：抗原可以用化學(xué)合成，如精制地高辛。 多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。用抗原免疫脾細(xì)胞的制備 ：有體內(nèi)免疫法和體外免疫法 。體內(nèi)免疫就是將抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，B細(xì)胞迅速增殖；體外免疫小鼠脾細(xì)胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，再分離脾細(xì)胞。 （2）細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：和免疫動(dòng)物同源，目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來(lái)自BALB/c小鼠（最常用）和 LOU大鼠。脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合：脾細(xì)胞（1108）和骨髓瘤細(xì)胞（2107）混合，在聚乙二醇誘導(dǎo)下融合2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。（常用PEG相對(duì)分子量4000，濃度為40-50%， 二甲基亞砜增加融合率）選擇性培養(yǎng):選擇培養(yǎng)基 為HAT培養(yǎng)液。 次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾瘤融合細(xì)胞可以生長(zhǎng)，脾脾、瘤瘤融合細(xì)胞死亡。（培養(yǎng)基中需要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能繁殖，常用飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等）（3）篩選陽(yáng)性克隆與克隆化篩選陽(yáng)性克隆常用檢測(cè)方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等?？寺』河邢尴♂尫ǎ▽?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。）和軟瓊脂法（將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動(dòng)，彼此互不相混，從而達(dá)到單細(xì)胞培養(yǎng)的目的）（4）雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析。另外還檢測(cè)抗體特異性、純度、分子量等。（5）單克隆抗體的大量制備 體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法，多采用后者 體內(nèi)誘生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接種雜交瘤細(xì)胞，取腹水，離心 ，取上清。（6）單克隆抗體的純化 依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。 體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：離心 取上清，超濾，鹽析。分離：凝膠過(guò)濾用于IgG IgM單抗純化；陰離子交換層析IgG單抗純化；親和層析 IgG單抗純化。3、ELISA法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。原理：酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。P147第三節(jié) 基因工程抗體及其制備（即鼠源性單克隆抗體的改造）1、基因工程抗體：過(guò)PCR技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床臨床診斷、預(yù)防、治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。P1502、Ig分子結(jié)構(gòu)P150（1）由2條重鏈(簡(jiǎn)稱H鏈)和2條輕鏈（簡(jiǎn)稱L鏈）組成Y字型結(jié)構(gòu)分子，鏈與鏈之間由一對(duì)或一對(duì)以上的二硫鍵互相連接（2）Ig分子氨基酸端L鏈的1/2與H鏈的1/4的氨基酸組成及順序多變，構(gòu)成可變區(qū)(簡(jiǎn)稱V區(qū))，V區(qū)中某些特定位置構(gòu)建抗體和抗原特異結(jié)合的關(guān)鍵部位，稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）它賦于抗體以特異性。（3）羧基端L鏈的1/2與H鏈的134的氨基酸組成及順序較恒定，構(gòu)成恒定區(qū)(簡(jiǎn)稱C區(qū))，它決定Ig分子的異種抗原性。（4）L鏈有VL和CL連個(gè)功能區(qū)，H鏈有VH、CH1、CH2、CH3四個(gè)功能區(qū)，VL和VH的CDR區(qū)共同構(gòu)成一個(gè)抗原結(jié)合部位。3、基因工程抗體及其特性和制備方法（P152圖4-4）（1）人鼠嵌合抗體：在基因水平上將鼠源單抗的H 和L鏈可變區(qū)（V區(qū)）基因分離出來(lái)，分別與人Ig的H 和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H 和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)完整人-鼠嵌合抗體。人IgC-小鼠IgV（2）改形抗體（CDR移植抗體）：用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig 分子中CDR序列，則可使人的Ig 分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性?？上庖咴葱?。小鼠CDR替代人CDR（3）Fab抗體：重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。（Fd：重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)）完整L鏈+重鏈V區(qū)+CH1功能區(qū)（4）Fv抗體：由VH和VL組成的具有完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段；VH+VL（5）單鏈抗體：即scFv，由VH和VL通過(guò)連接肽（接頭）重組并表達(dá)而成的一種小分子抗體，其分子量為整個(gè)Ig分 子的1/6具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低等特性。VH-多肽-VL（6）單域抗體：只有VH或VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。其分子量?jī)H為整個(gè)Ig分子的1/12。VH或VL（7）最小識(shí)別單位：即MRU，只含有一個(gè)CDR多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。第四節(jié) 多功能抗體及其制備1、雙功能抗體：bisFvs，即雙特異性單鏈抗體，（天然Ig是由兩個(gè)完全相同的VH和VL區(qū)域構(gòu)成，該區(qū)域是特異性識(shí)別并結(jié)合抗原的關(guān)鍵部位）經(jīng)人工設(shè)計(jì)構(gòu)建的雙特異性抗體由兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)組成，可同時(shí)與兩種不同的抗原決定簇結(jié)合，并可將其偶連的藥物、酶或放射性核素等導(dǎo)向到靶部位，這種具有雙價(jià)雙特異性的抗體又稱為雙功能抗體。P1552、多功能抗體：在scFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個(gè)或兩個(gè)以上的scFv重組在一起，由此可制備成多價(jià)小分子抗體即微型抗體（簡(jiǎn)稱多價(jià)微抗）。P1573、抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，稱之為抗體融合蛋白。P158第五節(jié) 抗體工程1、抗體工程：指利用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)抗體基因進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后，表達(dá)抗體分子，或用細(xì)胞融合、化學(xué)修飾等方法改造抗體分子的工程。P159現(xiàn)在普遍使用噬菌體作為抗體庫(kù)技術(shù)的載體。6噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)基本方法（過(guò)程）P159噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)：它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體?；具^(guò)程：噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)基本路線為用RT-PCR方法擴(kuò)增抗體全套可變區(qū)基因（VH+ VL），重組到噬菌體載體中，并通過(guò)與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv表達(dá)到噬菌體表面。通過(guò)“吸附洗脫擴(kuò)增”的富集過(guò)程，從中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。（右圖）第六節(jié) 抗體診斷試劑一、三大類抗體診斷藥物：血清學(xué)鑒定用抗體制劑、免疫標(biāo)記技術(shù)用抗體制劑、體內(nèi)導(dǎo)向診斷藥物。P161二、抗體診斷藥物有哪些類型？P1611. 血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑 （1）鑒定病原菌用的抗體試劑 （2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動(dòng)血凝診斷試劑 （3）妊娠診斷試劑 （4）抗ABO血型系統(tǒng)血清2、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑P164給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，可對(duì)微量抗原進(jìn)行定性定量測(cè)定，靈敏度提高。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可對(duì)抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的定位測(cè)定。 （1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達(dá)到診斷和定位的目的。 （2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標(biāo)診斷試劑 a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標(biāo)診斷試劑 b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標(biāo)診斷試劑 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標(biāo)診斷試劑 d、測(cè)定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標(biāo)診斷試劑 e、AFP（甲胎蛋白）酶標(biāo)診斷試劑 f、CEA（癌胚抗原）酶標(biāo)診斷試劑（3）放射免疫用抗體診斷試劑 把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性兩大特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)建立的檢測(cè)技術(shù)。能測(cè)出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質(zhì)。 常用的標(biāo)記抗體試劑： a、 HBsAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度0.1 ng/ml b、HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度0.1 ng/ml c、HAV抗原放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記 d、 AFP放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度15 ng/ml e、 CEA放射性核素標(biāo)記抗體診斷試劑： 125 I 標(biāo)記，靈敏度1 ng/ml 3、導(dǎo)向診斷藥物 由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導(dǎo)向藥物還未愛(ài)臨床廣泛應(yīng)用。三、CD單克隆抗體系列P169應(yīng)用以單克隆抗體鑒定為主的方法，將來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體所識(shí)別的同一種白細(xì)胞分化抗原歸稱為CD（cluster of differentiation）。人CD的編號(hào)已從CD1命名至CD247，大致分為13組。 第七節(jié) 抗體治療藥物1、抗體治療藥物有哪些？P173以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。（1）放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡(jiǎn)便用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。（2）抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物常用的抗癌藥物 氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性體高二倍。抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性（3）毒素偶聯(lián)的抗體藥物在導(dǎo)向藥物中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結(jié)合，使其僅在體外應(yīng)用。 第二代免疫毒素是利用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用。第三代免疫毒素重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達(dá)。特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。（3）免疫毒素的臨床應(yīng)用 治療腫瘤、自身免疫病，并能克復(fù)組織移植排斥反應(yīng)，可單獨(dú)給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其它微粒中給藥。第五章 植物細(xì)胞制藥第一節(jié) 基本概念1、植物細(xì)胞的全能性。P177植物體中任何一個(gè)具有完整細(xì)胞核（完整染色體組）的細(xì)胞，在一定條件下都可以重新再分化形成原來(lái)的個(gè)體。第二節(jié) 植物細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史（略）第三節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特性1、植物細(xì)胞是由細(xì)胞壁、原生質(zhì)體、后含物三大部分組成P1812、細(xì)胞壁、質(zhì)體、液泡三部分是植物細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有3、植物培養(yǎng)細(xì)胞重量的增加主要取決于對(duì)數(shù)期，而次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累主要在穩(wěn)定期（植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)期：延遲期、加速期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期四個(gè)時(shí)期）4、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性;P183（1）生長(zhǎng)階段特征v 延遲期：細(xì)胞數(shù)量不變，核酸及蛋白合成較快v 加速期：最大生長(zhǎng)期，最大細(xì)胞濃度v 對(duì)數(shù)期：細(xì)胞數(shù)呈對(duì)數(shù)增加v 穩(wěn)定期：細(xì)胞高液泡化，非常脆弱（2）植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞比較特征哺乳動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞大?。╩）1010010100110生長(zhǎng)懸浮、貼壁懸浮懸浮營(yíng)養(yǎng)要求很復(fù)雜較復(fù)雜很簡(jiǎn)單生長(zhǎng)速度（倍增時(shí)間：h）慢；15100慢；20120快；0.55細(xì)胞分化有有限分化無(wú)環(huán)境影響非常敏感敏感一般細(xì)胞壁無(wú)有有產(chǎn)物存在部位胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物濃度低低高含水量-約90約75供氧需求12520301001000產(chǎn)物種類疫苗、單抗、酶、生長(zhǎng)因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑酶、天然色素、天然有機(jī)化合物等發(fā)酵食品、抗生素、有機(jī)化合物、酶等第