生物化學(xué) 第二章 核酸化學(xué)

.,第二章,核酸的化學(xué),.,本章內(nèi)容,概述DNARNA核酸的性質(zhì),.,第一節(jié)核酸的發(fā)展歷史及研究現(xiàn)狀,.,核酸化學(xué)研究史（1）,1869年Miescher,博士論文工作中測(cè)定淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組成時(shí),發(fā)現(xiàn)了不溶于稀酸和鹽溶液的沉淀物,并在所有細(xì)胞的核里都找到了此物質(zhì),故命名核質(zhì)(Nuclein)1879年Kossel經(jīng)過(guò)10年的努力,搞清楚核質(zhì)中有四種不同的組成部分:A,T,C和G；,核酸研究史1,.,核酸化學(xué)研究史（2）,1889年Altman建議將“核質(zhì)”改名為“核酸”,因?yàn)橐呀?jīng)認(rèn)識(shí)到“核質(zhì)”乃“核酸”與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。1909年Levene發(fā)現(xiàn)酵母的核酸含有核糖1930年Levene發(fā)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的核酸含有一種特殊的核糖脫氧核糖,得出了一個(gè)錯(cuò)誤概念:植物核酸含核糖,動(dòng)物核酸含脫氧核糖。這個(gè)錯(cuò)誤概念一直延續(xù)到1938年，這時(shí)方清楚RNA和DNA的區(qū)別。Levene還提出了核酸的“磷酸核糖(堿基)磷酸的骨架結(jié)構(gòu),解決了DNA分子的線性問(wèn)題,還在1935年提出四核苷酸,認(rèn)為這四種堿基的含量是一樣的。,核酸研究史2,.,核酸化學(xué)研究史（3）,1950年Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用紙層析法仔細(xì)分析了DNA的組成成分,得知A=T,G=C,A+G=C+T1953年Watson,Crick根據(jù)DNA的X射線圖譜的研究結(jié)果,提出了DNA的雙螺旋模型(Doublehelix)。幾星期后提出了半保留式復(fù)制模型。1957年Meselsnhe又稱熱解鏈溫度。,四、核酸的性質(zhì),.,3、影響Tm的因素：,1）DNA的均一性；2）G-C含量：Tm與G-C含量成正比。3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度低，Tm低，熔解溫度范圍窄。,.,DNA分子的Tm與GC含量的關(guān)系,.,鹽濃度對(duì)DNA變性的影響,.,五、核酸的復(fù)性,概念：變性DNA在適當(dāng)條件下（緩慢降溫），可使兩條彼此分開的鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。復(fù)性后，許多物化性質(zhì)可得到恢復(fù)，生物學(xué)活性部分恢復(fù)。影響因素：溫度、DNA片段大小、DNA濃度、堿基重復(fù)序列多少、離子濃度。,四、核酸的性質(zhì),.,DNA變性與復(fù)性,.,第五節(jié)、分子生物學(xué)技術(shù),一、分子雜交與探針技術(shù)1、概念：1）分子雜交（hybrization):利用核酸變性、復(fù)性性質(zhì)，根據(jù)堿基配對(duì)原則，將二條不同來(lái)源的nt鏈形成雜合雙鏈的過(guò)程。DNA-DNA：DNA-RNA:,.,2)探針（probe),一小段（十幾至數(shù)百）多聚核苷酸單鏈用32P、35S或生物素標(biāo)記其末端或全鏈。制備：用確診病人細(xì)胞中提取的DNA；用病毒DNA；用腫瘤組織提取的DNA。,.,上：探針標(biāo)記右：放射自顯影,.,.,二、限制性內(nèi)切酶：,1、核酸的工具酶有：水解酶類；聚合酶類；連接酶；堿性磷酸酯酶；反轉(zhuǎn)錄酶；,.,2、水解酶：水解磷酸二酯鍵,1）按專一性分：DNA水解酶、RNA水解酶2）按作用方式分：外切酶：從核酸鏈3或5一個(gè)個(gè)水解。內(nèi)切酶：作用于核酸鏈內(nèi)部。,.,3、限制性內(nèi)切酶,在核苷酸鏈內(nèi)特定序列切開DNA雙鏈的酶。因切法不同，產(chǎn)生三種產(chǎn)物：交錯(cuò)切產(chǎn)生粘性末端：平切產(chǎn)生平頭末端：,.,粘性末端,.,應(yīng)用于克隆、測(cè)序、檢測(cè)DNA等,.,DNA凝膠電泳,.,三、Southern印跡法,分子生物學(xué)技術(shù),用于檢測(cè)DNA方法：如圖,.,Northernblot：用于檢測(cè)RNAWesternblot：用于檢測(cè)蛋白質(zhì),.,四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymeerasechainreaction,PCR),.,原理：堿基配對(duì)；聚合酶