QPCR原理ppt課件

兼顧速度與可靠性EppendorfPCR系統(tǒng),20YearsofPCR,KaryMullis,PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念。它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。摘自MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow,Denaturation94C,Annealing55C,Elongation72C,Pol,Pol,PCR,5,3,5,3,Separationofstrands,Annealingofprimer,Elongationbypolymerase,PCR后分析結(jié)果,PCRproductsindifferentsizes,3kb500bp300bp,為什么終點(diǎn)法定量不準(zhǔn)確?,同一樣品盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相對(duì)固定的。,典型的PCR四階段,半對(duì)數(shù)圖譜,線性圖譜,平臺(tái)期,典型的PCR四階段,線性增長(zhǎng)期,基線期,指數(shù)增長(zhǎng)期,PCR理論方程,lgDNA,循環(huán)數(shù),線性期,平臺(tái)期,y=x(1+e)n,指數(shù)期,N=N0 x(1+e)n,N:產(chǎn)物分子數(shù)N0:起始分子數(shù)e：擴(kuò)增效率n:循環(huán)次數(shù),PCR理論方程只在指數(shù)期成立,PCR指數(shù)增長(zhǎng)期的規(guī)律,PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá)：Yn=X(1+E)n0E1其中E表示擴(kuò)增效率，Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，X為n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過(guò)此周期數(shù)，擴(kuò)增過(guò)程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率，最終達(dá)到平臺(tái)，不再擴(kuò)增.,定量PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)為PCR擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期;而定性PCR測(cè)定的測(cè)定點(diǎn)則多為PCR擴(kuò)增的平臺(tái)期,為什么終點(diǎn)法定量不準(zhǔn)確?,同一樣品盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相對(duì)固定的。,Ct(ThresholdCycle)-Thecyclenumberwherethereactionfluorescenceexceedsbackgroundfluorescence.,Cycle#,Fluorescence,Threshold,Threshold-Thepeakofbackgroundfluorescence,asdefinedbytheplatformortheuser.,AmplificationPlot,定量分析原理,Yct=X(1+E)n=2nXEct=1,CT值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。CT值與起始模板濃度成負(fù)相關(guān)關(guān)系,不同CT值的模板起始濃度相差2n倍,n為CT間差值,為什么CT值起始DNA濃度?,當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=CT值時(shí)：,RCT=RB+X0(1+e)CTRslg(RCT-RB)=lgX0+CTlg(1+e)+lgRsCTlg(1+e)=-lgX0+lg(RCT-RB)lgRs,即CT=-klgX0+b（線性方程）,Rn=RB+X0(1+e)nRs,定量PCR的實(shí)質(zhì),模板定量找到PCR的指數(shù)增長(zhǎng)期定量數(shù)據(jù)歸一化,real-timePCR應(yīng)用范圍,科研的主要工具mRNA與基因表達(dá)的研究DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的測(cè)定DNA芯片結(jié)果認(rèn)證醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用前景更是令人鼓舞極微量的基因表達(dá)定量病原體檢測(cè),絕對(duì)定量,通常用標(biāo)準(zhǔn)品作為外參照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.注意保持與目的基因的同源性,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,什么是閾值,基線,閾值,標(biāo)準(zhǔn)偏差,基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差x10,基線閾值CT值,20-19-18-17-16-15-,CT,A,B,C,CT161819,Absoluteamount50,000copies12,500copies6,250copies,SampleASampleBSampleC,標(biāo)準(zhǔn)曲線方法,通過(guò)CT值測(cè)定起始DNA量,濃度增加1倍，CT值減小1個(gè)單位濃度增加10倍，CT值減小3.3個(gè)單位,相對(duì)定量,Sample,Nontreatedsample,2-Ct=ChangeinExpressionLevel,GeneofInterest,相對(duì)定量,DCt=9.70,DCt=-1.7,DCt=target-ref,DCt=target-ref,Difference=DCt-DCt=DDCt=9.70-(-1.7)=11.40,-2-Ct=-2(Ctarget-Ccalibrator)-(Ctarget-Ccalibrator),DNA芯片結(jié)果復(fù)證,DNA甲基化檢測(cè),BeforeBisulfiteTreatment:Wild-TypeDNA5.GCGGACCGCG.AfterBisulfiteTreatment:UnmethylatedDNA5.GUGGAUUGUG.MethylatedDNA5.GCGGAUCGCG.,高通量SNP篩查,AmplifluorPrimer(UniPrimer),Quencher,PCR,SNP,RealTimePCR技術(shù)的誕生,1992年，HiguchiR等第一個(gè)報(bào)導(dǎo)了實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11(9):1026-1030.,所謂實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法.,實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和熒光檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合,FluorescentDyes熒光分子或熒光染料,Exitationpeak,Emissionpeak,Reaction,AmplificationPlot,Time(Cycle#),Fluorescence,熒光信號(hào)累積與擴(kuò)增曲線,熒光分子或染料的檢測(cè)方法,熒光分子內(nèi)參式檢測(cè)（DNASpecificDyes）SYBRGreenI熒光標(biāo)記的特異探針?biāo)馓结?Taqman雜交探針:FRET（DualProbes）分子信標(biāo):MolecularBeacons熒光標(biāo)記引物:Scorpion和Amplifuor其它類:BDQZyme,DNAspecificDyese.g.SYBRGreenI,SYBRGreenI的檢測(cè)原理,熔解曲線分析引物二聚體,Primerdimers,ProductofInterest,UNG預(yù)防污染,UNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50C激活，95C滅活.用于預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。,在定量PCR開(kāi)始前增加50C的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染,儀器熱啟動(dòng),Innovativetechnicalfeaturefordevice-supportedHotStartPCRPerfectcombination:MastercyclerepSandHotMasterEnhancesthePCRtonearlythemaximum,脈沖PCR=超快的升溫速度+極大縮短初始升溫所需時(shí)間,6C/sec,8C/sec,TaqMan探針?lè)ǖ暮诵?利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)FRET熒光共振能量轉(zhuǎn)移FluorescenceResonanceEnergyTransfer,TaqMan探針原理,Reporter,Quencher,Real-TimeQPCR常用染料,TaqMan探針原理,多探針的反應(yīng)體系,TwoormoreProbesandDyesinoneTube,Target1,Target2,微衛(wèi)星系統(tǒng),Mastercyclerep-新一代PCR儀的代表,超快的升/降溫速度,脈沖PCR,獨(dú)立直觀的控制面板,ESP電子樣品保護(hù)熱蓋,Mastercyclerep系列-多種模塊選擇,鋁塊,鋁塊,銀塊,Eppendorf在定量PCR領(lǐng)域厚積薄發(fā),Mastercyclereprealplex實(shí)時(shí)定量PCR儀的開(kāi)發(fā)秉承了Eppendorf既往的經(jīng)驗(yàn).是將經(jīng)驗(yàn)融入最新技術(shù)的精品之作回顧Eppendorf60年的發(fā)展歷史，當(dāng)之無(wú)愧為高品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室儀器的供應(yīng)商。Eppendorf擁有55年生產(chǎn)光學(xué)儀器的經(jīng)驗(yàn)，近10年來(lái)，熱循環(huán)儀已成為Eppendorf產(chǎn)品家族中的重要組成。,real-timePCR儀器構(gòu)造,Exitationlightsource,Filter,Detector,熱循環(huán)儀,光學(xué)元件,軟件分析,Mastercyclereprealplex,A4-colourdetectionunitinaspacesavingdesign,ThermalModule,SlidingOpticsModule,Mastercyclerep升級(jí)為定量PCR儀,epGradient/S,兩通道epRealPlex2,四通道epRealPlex4,六通道epRealPlex6,COMINGSOON!,在Mastercyclerep梯度PCR的基礎(chǔ)上，整合一個(gè)可靠而高度靈敏的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，就構(gòu)成了最新的Mastercyclereprealplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)。,Mastercyclereprealplex-模塊化設(shè)計(jì),A.Mastercyclereprealplex296LEDArrayexcitationat470nm1channelphotomultiplier(CPM)2detectionwavelenghts:520nmand550nm,B.Mastercyclereprealplex496LEDArrayexcitationat470nm2channelphotomultipliers(CPM)4detectionwavelengths:520nm,550nm,580nm,605nm,TwoThermomodulesAluminumblock(epgradient):4C/sheating,3C/scoolingSilverblock(epgradientS):6C/sheating,4.5C/scooling,impulsePCR,Mastercyclereprealplex2：光路特征,96LEDArray,CPMDetector,每個(gè)CPM上帶兩個(gè)濾光片,96孔激發(fā)模式,由96個(gè)LED（光電二級(jí)管）組成的光陣列，依一種一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系將每個(gè)反應(yīng)管中的熒光染料激發(fā)，SYBRGreen,FAM,VIC,TET,HEX,ROX,JOEandTAMRA優(yōu)點(diǎn):設(shè)計(jì)緊湊，無(wú)可移動(dòng)部件低能耗,無(wú)光密度損失相對(duì)于傳統(tǒng)的鹵素?zé)?，壽命更長(zhǎng),檢測(cè)器-通道式光電倍增管,相對(duì)于傳統(tǒng)的光電倍增管，新穎的通道光電倍增管（CPM）結(jié)構(gòu)更堅(jiān)固，更不易被磁場(chǎng)所干擾快速數(shù)據(jù)獲取:15秒檢測(cè)4種染料,RTCCDiCycler,CooledCCDABI7000,ABI7900,7300,PMTRotoGene,Sensitivity,CPMrealplexep,敏感性,-Photoncascadecreatesexponentialsignalamplification-“Gain”ofPMTadjustsstrengthofamplification,hv,e-,e-,CCDvsPMT檢測(cè)性能對(duì)比,CCD無(wú)法克服檢測(cè)的邊緣效應(yīng),快速qPCR新理念,非?？焖俚臏囟瓤刂扑俣龋浜峡焖俚臋z測(cè)、直觀的編程與軟件分析，縮短了實(shí)時(shí)定量PCR的整體時(shí)間。兼顧速度與可靠性,優(yōu)化參數(shù)實(shí)現(xiàn)快速PCR,試劑與耗材均為開(kāi)放,快速Q(mào)PCR的實(shí)現(xiàn),主要因素:快速升/降溫Heatingrate:6oC/sCoolingrate:4.5oC/sonaverage,atimesavingof15-20min.減少holding時(shí)間快速數(shù)據(jù)獲取減少反應(yīng)體積,MasterCyclerepRealPlexSoftware,MastercyclereprealplexSoftware,Thesoftwareofferthefollowingpossibilitiesforevaluatingorviewingtherecordeddata:RawdataAbsoluteQuantificationRelativequantificationMeltingpointdeterminationEndpointdetermination+/-assaysgeneidentificationfluorimeterOnlineanalysisofrawdataastheyappear,Software-AbsoluteQuantification,SoftwareModules:PlateLayoutforAbsoluteQuantification,Redboxes-standards,Blueboxes-unknowns,Yellowboxes-“-”control,Chooseadye,AutoSeriesfunction,Creatingdilutionseriesforabsolutequantificationiseasilydoneusingthe“AutoSeries”function,Mastercyclereprealplex-Software,Usercancreatesubassaystoperformdifferentexperimentsinthesameplate,providedthattheexperimentssharethesamePCRprotocol.,Mastercyclereprealplex-Software