醫(yī)學科研的基本要素

.,醫(yī)學科研的基本要素南華大學衛(wèi)生學教研室,.,醫(yī)學科研的基本要素講授提要一、被試因素1、被試因素的確定2、水平的確定3、因素與水平的組合4、被試因素的施加二、受試對象受試對象的（確立、條件、純化）受試對象影響因素的控制受試對象的依從性,.,三、試驗效應科研指標的要求與注意事項四、中醫(yī)科研的要素問題1、被試因素是中醫(yī)學發(fā)展需要的問題2、受試對象應當貫徹病證結合的原則3、觀察指標必須從中醫(yī)現(xiàn)代化出發(fā).,.,何謂醫(yī)學科研的基本要素？下面看一個事例：腫瘤壞死因子對人臍靜脈內皮細胞組織因子和凝血酶調制素表達的影響研究課題。仔細分析這一研究課題它由三要素組成，即：被試因素（腫瘤壞死因子），受試對象（人臍靜脈內皮細胞），試驗效應（組織因子和凝血酶調制素）。,.,通常將這三個組成部分稱為科研的三要素，涉及醫(yī)學科方面的研究即為醫(yī)學科研的三要素。如何正確選擇三要素，這是科研設計的關鍵問題。下面分別介紹：,.,一、被試因素,.,1、被試因素的確定被試因素簡稱因素(factor)或處理(treatment)。被試因素是由外界施加于受試對象的各種處理內容。來源：生物的、化學的或物理的。受試對象本身的某些特征(如性別、年齡、遺傳特性、心理因素等)。例如性別和年齡與心肌梗死患者死亡的關系課題，性別和年齡就是被試因素。,.,ABO血型與成人男性血液流變性的關系課題，ABO血型就是被試因素。怎樣選擇被試因素：取決于試驗目的。如：研究刺激與平滑肌機械反應的關系，無疑刺激是被試因素；研究藥物對某病的療效，必然藥物是被試因素，研究危險因素與某病病情和預后的關系，必然危險因素是被試因素。假說被試因素本身含糊不清或張冠李戴，那么整個科研工作就會從根本上被否定。,.,注意區(qū)分非被試因素：如：對于反應、療效、病情和預后等情況，除被試因素起作用外，同時還有若干其他因素也會影響這些效應和結果的非被試因素。如何處理非被試因素：確定被試因素的同時，還須明確哪些是非被試因素。將非被試因素，作為誤差來源嚴格控制。減小非被試因素影響。不能減小的非被試因素應使試驗組與對照組保持均衡一致。,.,例如異搏定對大鼠肺動脈內皮細胞黃嘌呤氧化酶活性的影響研究。異搏定是被試因素，但是細胞數(shù)量、細胞外鈣離子濃度、氧分壓、次黃嘌呤含量、pH、溫度等均可影響黃嘌呤氧化酶的活性，因此試驗組與對照組除被試因素不同以外，所有這些非被試因素都應當保持齊同。,.,2、水平的選定被試因素作用于受試對象引起的效應與水平(1evel)有著依賴關系。如：以藥物作為被試因素，劑量就是水平。在科研中，被試因素水平的選擇，取決于試驗目的。注意：被試因素不能過大、過小。被試因素過大可能引起損害或中毒，過小則不可能觀察到應有的效應。,.,例如觀察一個新的藥物效應，必須確定劑量-效應關系的存在；如果沒有劑量-效應關系，那么這是一種非特異性作用。在最小有效量與最大安全量范圍內，研究目的不同，使用劑量也應有所不同。,.,例如：進行藥效篩選試驗，希望不要漏掉有效藥物，那么應選擇最大安全量，通常采用半致死量(LD50)的l10左右。若研究藥效的影響因素，則應采用半數(shù)有效量(ED50)，因為在這個水平藥效曲線的斜率最大，如某因素對藥效有影響，則可明顯的反映出來。,.,假如進行毒性試驗(如：烹調油煙毒性試驗），則應選擇超過最大安全量的不同劑量，以分別找出半數(shù)致死量(LD50)與最大致死量(LDloo)。但若進行兩種藥物的藥效比較試驗，則兩者均應采用多個不同劑量，以便對兩個藥物的劑量效應曲線進行較全面的分析。由此可見，正確選定被試因素的水平是十分重要的。,.,3、因素與水平的組合依照研究因素與水平的數(shù)目，可產生四個不同類型組合，實際也就是四類不同的實驗。單因素單水平科研中最常見的實驗類型。如“夏枯草提出物對原發(fā)性高血壓患者降壓作用的觀察”就屬單因素單水平試驗。優(yōu)點：這類實驗的條件較易控制，相對簡單易行。缺點：若有多個因素待試時，則進度太慢。,.,單因素多水平屬單因素多群組的試驗。如：比較同一刺激不同強度的反應，比較不同劑量藥物對某病的療效觀察，屬于這類試驗。特別是珍貴藥物、毒性較大的藥物或新藥劑量的最佳選擇，往往需要采用這類試驗。如“不同分子量肝素對大鼠內毒素血癥的療效比較”，便屬于這類試驗。,.,、多因素單水平比較不同藥物、不同療法、不同復方、同一復方中的不同單味中藥、同一單味中藥中不同有效成分的療效，或者比較不同因素在某一疾病中的作用，通常需要采用這類試驗。如中西醫(yī)結合研究中，比較中藥與西藥聯(lián)合的療效，屬于這類試驗。,.,多因素多水平事物之間的聯(lián)系是復雜的，生物效應更是如此。在許多情況下，應當考慮多個因素聯(lián)合作用。在多因素聯(lián)合作用中，到底哪個或哪幾個因素是主要的?哪個或哪幾個因素是次要的?,.,它們彼此之間有無交互作用?回答這些問題，就應當采用多因素多水平實驗。例如：研究酶學試驗的最佳反應條件、探索聯(lián)合用藥方案、研究中藥復方等等，多因素、多水平便是常用的試驗類型。,.,4、被試因素的施加確保被試因素被施加確保被試因素被施加是保證實驗結果準確的重要環(huán)節(jié)。為此要考慮到以下方面：被試因素如藥物注射法較易控制，但要注意取量的準確性。,.,對口服被試藥物，病人是否真正服用試驗藥物，應以觀察者親眼見到受試對象服下為準。在動物實驗中，慢性實驗應當采用空腹灌胃，急性實驗最好采用十二指腸給藥。,.,施加條件標準化,被試因素的強度、頻率、持續(xù)時間與施加方法等，都應通過查閱文獻和預備試驗找出各自的最適條件,然后訂出有關規(guī)定和制度，使之相對固定。一旦進入正式實驗，不允許輕易改變；如確需改變，一般應將被試因素實驗條件改變前后的實驗結果分別予以處理。,.,如:被試因素是藥物，應當在科研全過程使用同一批藥物，以防批間差異干擾實驗結果。如被試因素系中藥，則應正確選擇藥物劑型，并使之標準化和相對固定化。,.,同一中藥或復方，不同劑型的有效成分及其含量是不同的；即使同一煎劑，由于煎法不同，其有效成分與含量也會有所差異。因此煎煮方法與時間都應選擇最佳條件，并將其固定下來。,.,、給藥時間固定化在臨床醫(yī)學科研中，藥物是最常見的被試因素。由于生物節(jié)律的存在，不同時間藥物的毒副作用與療效是不一致的。例如相同劑量的尼可剎米，下午2點給藥可使67小鼠死亡，而凌晨2點給藥小鼠死亡率僅33。,.,普萘洛爾(心得安)的半致死量在下午7點為98.5ngkg，上午11點則為129.4ngkg。由于給藥時間不同，相同劑量藥物的作用強度可有很大的差異。例如同劑量洋地黃，夜間給藥可比白天給藥敏感性高約40倍；糖尿病人凌晨4時左右對胰島素最敏感。因此每天給藥時間應當固定。,.,藥物毒副作用與療效的大小，不僅有晝夜節(jié)律，而且還存在季節(jié)性節(jié)律的影響。例如苯丙胺的LD50，一月份明顯小于七月份。環(huán)磷酰胺與氮芥的致畸作用在春夏季較高，冬季最低。,.,吲哚美辛(消炎痛)的抗炎作用在二月份表現(xiàn)為上午8點作用較強，下午8點作用較弱，但在六月份用藥，晝夜節(jié)律就變得不明顯了?？紤]到時間因素影響，故對比性實驗應當強調平行進行，絕不能實驗組與對照組分別在不同時間與季節(jié)進行。,.,正確選擇給藥途徑與劑量給藥途徑不同，藥物吸收速度與作用方式也不同。一般說來，就藥物的吸收速度而言，肌肉腹腔皮下胃腸道。口服由腸道吸收，相當一部分有效成分首先在肝受到生物轉化作用；,.,皮下、肌肉與靜脈注入后，一部分有效成分首先在肺受到生物轉化作用；動脈內給藥則主要作用于被灌流器官。因此，同一藥物口服與非胃腸道給藥，其作用可能并不完全相同。所以，正確選擇給藥途徑，對于醫(yī)藥科研是十分重要的。,.,此外，不同途徑給藥的用量亦應不同。若以口服量為100時，灌胃亦為100，灌腸(直腸)為100200，皮下注射為3050，肌內注射為2530，腹腔注射為2530，靜脈注射2025.假如觀察的藥物是新研制的，或是由某中藥新提出的有效成分；試用時的靜脈注入量一般為LD50的l/15l/50。,.,二、受試對象,.,1、受試對象的確定2、受試對象的條件3、受試對象的純化4、受試對象影響因素的控制5、受試對象的依從性,.,1、受試對象的確定醫(yī)學科研的受試對象(object)：人或動物，植物（藥物研究）。根據(jù)具體情況可采用整體作受試對象，在體內進行試驗(invivo)；也可采用器官、組織、細胞、亞細胞或分子作為受試對象，在體外進行試驗(invitro)；,.,也可采用先體內后體外的方式進行試驗，這類試驗屬半體內試驗(exvivo)。在醫(yī)學科研中究竟在什么層次上進行試驗，這服從于工作假說檢驗的需要。,.,怎樣確定受試對象：受試對象的確定取決于試驗目的。如研究參考值(正常值)范圍，應當選擇健康人作為受試對象，通常需要在不同性別與不同年齡分別選擇較多的健康人或“相對健者”(指未患有影響該指標的疾病和未患有重要臟器疾病的人)。,.,假如研究病因學，往往需要將暴露于與未暴露于某危險因素的人進行比較。倘若研究某病診斷方法，通常需要選擇確診本病的患者與未患本病的人，以便了解該方法的敏感度與特異度。,.,如果觀察某藥與某療法對某一疾病或某病癥的療效，需選擇確診為本病或本病癥的患者。假如進行計劃生育研究，則應以具有較強生育能力的青壯年作為受試對象。,.,倘使觀察藥物的毒性與副作用及藥物代謝動力學過程，則可采用志愿者(volunteer)；但是志愿者由于心理與經(jīng)濟等多種因素的影響，可能影響研究結果，甚至易于出現(xiàn)假陽性，所以采用志愿者，應持慎重態(tài)度。,.,2、受試對象的條件在醫(yī)學科研中，作為受試對象的前提是所選對象必須同時滿足兩個基本條件：必須對被試因素敏感反應必須比較穩(wěn)定例如：臨床上觀察某個藥物對高血壓病的療效，期高血壓患者對藥物不敏感，I期患者，本身血壓波動范圍較大，因此一般應選擇期高血壓病患者作為觀察對象。,.,其次，受試對象必須具有可能性，不僅易于取樣，安全性好，而且應當以有利于病人診治為原則。此外，在臨床療效科研中，應當選擇具有明顯變化的客觀指標患者作為受試對象。例如，冠心病不宜選擇僅有心前區(qū)不適癥狀的患者，而應選擇有缺血性心電圖改變的患者,.,不宜作為一般臨床科研的受試對象（存在以下情況之一者）：存在影響反應結果的并發(fā)癥。危重狀態(tài)。多種療法無效(機體反應性和或致病因素與二般病例不同)。不能配合者。但若專門研究合并癥、危重病癥或頑固性(難治性)病癥時，理所當然地應以這類患者作為受試對象。,.,3、受試對象的純化受試對象的疾病應是確診的，且表現(xiàn)具有典型性。非典型的特殊病例不宜作為受試對象，因為特殊病例提示機體或致病因素與一般病例存在差異。,.,受試對象的病情一般不宜過重或過輕，因病情過重，死亡率很高，不易反映被試因素的療效；若病情過輕，稍加處理即可痊愈，難以區(qū)分不同被試因素的優(yōu)劣。,.,因此，只有通過對病情中等病例得到肯定結論后，才宜擴大觀察輕、中、重三類不同病情患者。病人的既往史也很重要，如第二、第三次心肌梗死患者的死亡率明顯高于初次發(fā)作者，因此，它亦應作為純化分層的依據(jù)之一。,.,疾病診斷與病情分級的標準務必按照全國有關專業(yè)學術會議的規(guī)定；如無統(tǒng)一規(guī)定，則可邀請三個以上外單位專家參加集體討論制定，切忌個人主觀臆斷。中醫(yī)臨床科研受試對象的診斷除應有中醫(yī)診斷外，還必須有西醫(yī)診斷。,.,4、受試對象影響因素的控制試驗組與對照組性別和年齡均衡。不同性別與年齡的人，他們的激素、代謝與器官功能均有一定的差異，這些因素對許多疾病的療效都有一定的影響。,.,一般試驗首先選擇中青年人作為受試對象，只有肯定療效后才能擴大到兒童與老年進行觀察。除非專門研究妊娠有關課題，一般不應選擇孕婦作受試對象。,.,試驗組與對照組手活習慣與嗜好要均衡。生活習慣與嗜好也可以影響試驗結果。首先，吸煙可使PGI2合成減少，明顯影響動脈粥樣硬化與慢性阻塞性肺疾患的治療效果。,.,其次，居住條件與家庭負擔等因素也可影響療效，尤其是發(fā)病與精神因素有關的疾病更是如此。此外，飲食因素與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關，如刺激性強的食物易使胃部疾病復發(fā)；食用大量黑木耳可能導致出血傾向。,.,控制這些影響因素，住院病人較易做到，門診病人往往難以實現(xiàn)。所以，臨床療效科研最好以住院病人為受試對象，將用藥的種類、劑量、次數(shù)與服藥時間嚴格控制，使之一致，這樣試驗才真正具有可比性。只有無法對住院病例進行觀察時，才能選用門診病人作為觀察對象。,.,5、受試對象的依從性受試對象的依從性指他們按預定計劃接受被試因素的合作程度.絕對的依從只有在麻醉動物實驗才能見到。一般患者由于心理、社會、經(jīng)濟等多方面原因而可能出現(xiàn)忘記服藥、中途退出實驗或換組。這些不依從性表現(xiàn)必然干擾實驗計劃的完成。,.,因此，必須充分關心體貼病人，做好病人思想工作，使病人建立對醫(yī)務人員的充分信任與依賴的心理狀態(tài)，從而提高病人的依從性。還應當控制試驗時間，試驗時間過長，病人往往依從性減低。此外，在設計時應制定一旦出現(xiàn)不依從情況的補救措施,.,三、試驗效應,.,三、試驗效應試驗效應(effect)被試因素作用于受試對象所引起的試驗反應(reaction)。試驗效應總是通過具體試驗指標來反映的，因此效應指標的正確選定是非常重要的。下面著重介紹科研指標的選擇：,.,1、科研指標的要求：、指標的關聯(lián)性、指標的客觀化、指標的靈敏度、指標的可用性、測定的精確性,.,指標的關聯(lián)性選用的指標必須與所研究的題目具有本質性聯(lián)系，且能確切反映被試因素的效應。所選指標是否符合關聯(lián)性要求，這往往反映科研工作者的專業(yè)知識與技術水平。,.,在指標選擇中，切忌“想當然”的作法。一般說來，功能性指標應與所反映的功能存在本質聯(lián)系。對于血糖測定，若用班氏試驗，易受體內還原物質影響，讀數(shù)往往偏高，應采用特異性高的葡萄糖氧化酶方法。但是必須明確，人類科學技術是不斷發(fā)展的，科研工作者應當及時了解最新信息，（不斷查新）以使自己的科研工作應用的指標更好地具有高度關聯(lián)性。,.,如：長期以采以丙二醛(MDA)作為反映體內活性氧造成脂質過氧化的指標，其實MDA不僅脂質過氧化可以產生，它也可以是血小板正常代謝產物?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)異構前列腺素(isoprostane)是活性氧直接催化脂質生成的脂質過氧化產物，它的生成既不要酶參與，也不需花生四烯酸脫下，因此就活性氧引起脂質過氧化的指標而言，目前也出現(xiàn)了以異構前列腺素取代丙二醛的趨向。,.,、指標的客觀化指標分：主觀指標和客觀指標。主觀指標和客觀指標的劃分，這是由指標數(shù)據(jù)來源決定的。主觀指標：指標數(shù)據(jù)是由觀察者或受試對象根據(jù)主觀感受程度判定的。如，中醫(yī)診病，望、聞、問、切是靠受試者的回答和觀察者憑借感受而加以判斷。,.,特點：主觀指標較易受觀察者與被試者兩方面的主觀因素的影響，其指標易受心理狀態(tài)與暗示程度的影響，并且感覺器官的感受往往由于背景條件與對比誘導可發(fā)生較大的差異。因此在科研中應盡量少用主觀指標。,.,客觀指標：指標數(shù)據(jù)由儀表指示的。如：心電圖、血細胞自動計數(shù)等就屬于客觀指標。特點：目前生物科學技術還不夠發(fā)達，有些反應尚無適當?shù)目陀^指標。（上述中醫(yī)的四診尚未無確切的客觀存指標）有些客觀指標靈敏度遠不如主觀感受。,.,科研中要正確運用主觀、和客觀指標。對于主觀指標，在可能范圍內應盡量消除觀察者的主觀因素影響。例如，X線胸片中的陰影，雖照片本身是客觀的，但描述與取值則是主觀的，故仍屬主觀指標。如：兩名醫(yī)師分別讀同一批片子共8931張，結果不一致的占301(2686張)。同一醫(yī)師在兩個不同時間分別閱同一批片子(893張)，結果不一致的占215(192張)。,.,由此可見，對于這類指標應采取多人、分別觀察、盲法判定，而后采用加權平均值法，從而消除主觀因素的影響。因為多人可以防止片面性，分別觀察可以消除彼此之間的干擾與影響，盲法可以防止偏見。,.,、指標的靈敏度指標的靈敏度通常是由該指標所能正確反映的最小數(shù)量級或水平來確定。在形態(tài)學方面，光學顯微鏡可判斷組織和細胞水平的改變，電子顯微鏡可判斷亞細胞超微結構的改變，細胞分光光度計可以測定細胞內某些物質含量的改變。,.,對于溶液中物質含量的測定，除檢出下限外，尚可用檢出的最低改變濃度來反映靈敏度。最低濃度常以mgL和gL等單位表示。,.,正確選擇靈敏度：作為科研指標，要求其靈敏度能正確反映被試因素對受試對象所引起的反應，并不是靈敏度越高越好。譬如，測定全血的血紅蛋白含量，則可用氰正鐵血紅蛋白法，以gl為單位；,.,測定血漿游離血紅蛋白可采用苯息丁法，以gL為單位。再如,測定小鼠體重，以感量為0.5g的藥物天平即可，若采用感量為0.1mg的分析天平，顯然是不必要的，也是不應該的。,.,、指標的可用性指標的可用性是由該指標的敏感性(敏感度)與特異性(特異度)來決定的。在醫(yī)學上，理想的試驗是陽性只出現(xiàn)在本病存在的條件下，本病不存在時試驗是陰性。,.,可是絕大多數(shù)生物學與醫(yī)學試驗，由于生物個體之間存在差異與試驗結果呈正態(tài)分布或拖尾的偏態(tài)分布，故從試驗結果來看，患本病者與未患本病者通常在分布上存在不同程度的交錯重疊現(xiàn)象(圖52)。,.,.,如以a為真陽性數(shù)，b為假陽性數(shù)，c為假陰性數(shù)，d為真陰性數(shù)。試驗的敏感性(se)就是真陽性率，試驗的特異性(sp)就是真陰性率。它們的求取公式如下：從臨床角度考慮，(1一Se)就是漏診率，(1Sp)就是誤診率。,.,對于大多數(shù)試驗而言，在樣本含量確定的條件下，敏感性與特異性存在反變關系。因此，選擇指標時不能只考慮敏感性或特異性一方，而應將二者綜合起來考慮。試驗指標的綜合評價常用以下兩個辦法：作為科研指標，一般要求診斷指數(shù)150，診斷效率0.75，可用度0.500若有多個試驗指標可供選擇時，應選診斷指數(shù)高的試驗。如幾個試驗的診斷指數(shù)相近時，則應選用其中可用度高的試驗。,.,、測定的精確性精確性包括：指標的精密度與準確度。準確度：是測定值與真實值接近的程度。即：測定正確性的量度。通常以偏差系數(shù)(CB)來表示。精密度：是各次測定值集中的程度。它與變異系數(shù)(CV)成反比。重復性：在相同條件下多次取樣測定結果的精密度。,.,平時強調試驗結果的可重復性，就是在相同條件下多次取樣測定結果的精密度。從科研的要求來看，第一位必須準確，第二位要求精密。既準確又精密最好，準確但精密度不很高尚可，但精密度高而準確度差則不行。,.,以R代表回收率()，x代表測定均值，s代表測定值標準差，則偏差系數(shù)與變異系數(shù)：偏差系數(shù)CB()100R變異系數(shù)CV()s/x100對于不同指標，偏差系數(shù)與變異系數(shù)的要求是不同。即不同指標的精確性要求也是不一致的。指標的精確性與檢測指標的方法、儀器、試劑及試驗條件有關外，還取決于技術水平及操作情況。因此，在固定其他條件后，以此來考核科研人員的技術情況。,.,2、科研指標的注意事項作為科研指標，除指標應當符合以上五個條件要求外，還應注意以下幾個問題：、標本采集與貯運標準化、實驗方法必須標準化與固定化、不能搞“單打一”、從實際出發(fā)、盡量爭取高、精、尖、新、高度重視實驗方法的可靠性、避免其它因素對指標的干擾,.,標本采集與貯運標準化標本的采集方法、部位、時間、保存與運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)都應標準化。例如：測定血小板TXB2，除要求患者采血前一周未服過非類固醇抗炎藥外，抽血必須使用硅化或塑料管和注射器；抽血時采用肘靜脈，以較大針頭，力爭一針見血.,.,使用EDTA-Na2抗凝，抗凝液中還應含消炎痛與抑肽酶；運輸過程中應避免強烈震動；離心制備貧血血小板血漿，而后貯存于一20以下待測?？傊?，多個環(huán)節(jié)都應避免凝血酶的形成與血小板活化，使測得的TXB2的確是體內抽血前已形成的，而不是抽血后血小板活化產生的。,.,、實驗方法必須標準化與固定化第一，同一指標用不同方法，其結果的差別往往是很顯著的。例如，血小板計數(shù)以枸櫞酸鈉抗凝，由于存在一定程度血小板聚集，計數(shù)結果往往低于肝素抗凝標本；因為EDTA螯合鈣離子最完全，故以EDTANa2抗凝血液的血小板計數(shù)又略高于肝素抗凝。,.,第二，不同儀器之間也總具有一定的誤差。不同廠家的產品與不同等級的試劑有時也會使指標發(fā)生顯著改變。,.,第三，其它實驗條件也可能在一定程度上影響實驗結果。例如，時間因素等等。因為許多生理指標由于生物鐘而呈周期性波動。此外，每個檢測人員習慣多少存在一定的偏性，所以，實驗指標的檢測方法應當標準化，儀器、試劑、條件、時間與人員都應固定。,.,、不能搞“單打一”無論哪種指標，不可能絲毫不受其它因素的影響，靈敏度越高的指標，影響因素可能越多，越易出現(xiàn)假陽性(或假陰性)結果。因此，在科研中應選用一種以上的不同方法與指標，以相互驗證。只有多方法多途徑全面觀察，才有可能準確地了解事物的全貌。臨床上總以多項指標檢查肝功能，這也是重要原因之一。,.,在肝癌的實驗診斷中，反向間接血凝抑制試驗檢查甲胎蛋白(AFP)，這是一個相當敏感的指標，但是假陽性率也較高，故不可單純根據(jù)這一指標來確診肝癌。,.,又如急性DIC的診斷：一般應包括血小板計數(shù)、纖維蛋白原定量、凝血酶原時間、凝血酶時間、血漿魚精蛋白副凝試驗和FDP免疫學試驗(Fi試驗)等項。絕對不能僅僅根據(jù)某一項指標而加以肯