診斷酶學(xué)(第五版)12.ppt

診斷酶學(xué),臨床生物化學(xué)檢驗(yàn),林孟戈,本章學(xué)習(xí)過(guò)程中請(qǐng)你思考:,1、酶學(xué)分析中工具酶參與的指示反應(yīng)有哪些？2、血清酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)有哪些？3、同工酶及其亞型的測(cè)定有哪些方法？4、臨床常用血清酶測(cè)定有何臨床意義？5、連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性濃度的原理和應(yīng)用。,第一節(jié)概述,（一）酶的組成、結(jié)構(gòu)和功能,酶的本質(zhì)-絕大部分的酶是蛋白質(zhì)，有些酶是核酸和酶蛋白組成的復(fù)合體，極少數(shù)酶的本質(zhì)是核酸。酶的特性-極高的催化效率、高度的特異性(specificity)以及催化作用的可調(diào)節(jié)性,一、酶的概念與特征,酶的結(jié)構(gòu)和功能,酶是蛋白質(zhì)，具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，有些酶還具有四級(jí)結(jié)構(gòu)。單體酶(monomericenzyme)-只由一條多肽鏈構(gòu)成寡聚酶(oligomericenzyme)-由多個(gè)相同或不同亞基以非共價(jià)鍵連接的酶多酶體系(multienzymesystem)-由幾種不同功能的酶彼此聚合而成的多酶復(fù)合物酶的必需基團(tuán)(essentialgroup)-與酶的活性密切相關(guān)的基團(tuán)酶的活性中心(activecenter)-組成具有能與底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的特定空間結(jié)構(gòu)區(qū)域,（二）酶的催化作用機(jī)制,酶主要通過(guò)與底物形成一種或多種中間復(fù)合物來(lái)降低反應(yīng)的活化能。在酶促反應(yīng)中，酶與底物結(jié)合時(shí)，底物首先和酶分子上的活性中心相結(jié)合，形成酶底物中間復(fù)合物（ES），降低反應(yīng)的活化能，顯著提高了反應(yīng)速度。,（三）酶的命名、分類(lèi)與編號(hào),酶的命名-習(xí)慣命名法、系統(tǒng)命名法酶的分類(lèi)-可分為六大類(lèi)氧化還原酶(oxido-reductases)、轉(zhuǎn)移酶(transferases)、水解酶(hydrolases)、裂解酶(或裂合酶)(lyases)、異構(gòu)酶(isomerases)、合成酶(或連接酶)(synthetases或ligases)酶的編號(hào)-用4個(gè)數(shù)字加以系統(tǒng)編號(hào)第一個(gè)數(shù)字表示酶的類(lèi)別，第二個(gè)表示亞類(lèi)，第三個(gè)表示亞-亞類(lèi)，第四個(gè)表示酶的編號(hào)序數(shù)。,酶的命名-習(xí)慣命名法、系統(tǒng)命名法,（四）酶分類(lèi)與編號(hào),習(xí)慣用名英文縮寫(xiě)EC編號(hào)系統(tǒng)名乳酸脫氫酶LD（LDH）1.1.1.27L乳酸：NAD+氧化還原酶單胺氧化酶MAO1.4.3.4單胺：氧化還原酶-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶-GT/GGT2.3.2.2-谷氨酰肽：氨基酸-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST2.6.1.1L-門(mén)冬氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶）(GOT)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT2.6.1.2L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）(GPT)肌酸激酶CK2.7.3.2三磷酸腺苷：肌酸轉(zhuǎn)磷酸酶堿性磷酸酶ALP(AKP)3.1.3.1正磷酸單酯磷酸水解酶,臨床酶學(xué)分析中常用酶的名稱(chēng)與編號(hào),二、同工酶的概念與特征,同工酶是指催化相同化學(xué)反應(yīng)，但酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。根據(jù)同工酶的來(lái)源和結(jié)構(gòu)不同，從基因角度可將其分為單基因決定的同工酶、復(fù)等位基因同工酶、多基因決定的同工酶和修飾同工酶四類(lèi)。,三、工具酶,通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱(chēng)為工具酶。常用工具酶多為氧化還原酶類(lèi)。,1偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反應(yīng),利用葡萄糖氧化酶等工具酶使相應(yīng)底物被氧化生成H2O2。在POD的直接催化下，H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色的色素,再進(jìn)行比色測(cè)定。,2NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng),作為工具酶的脫氫酶如LD將底物的氫原子去除后傳遞給NAD(P)+而形成NAD(P)H。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。,（一）工具酶參與的指示反應(yīng),（二）酶循環(huán)法,（405nm）,（三）代謝物濃度的酶法測(cè)定技術(shù),直接法1終點(diǎn)法酶偶聯(lián)法2動(dòng)力學(xué)法,第二節(jié)酶測(cè)定技術(shù),酶活性測(cè)定主要利用酶有加速化學(xué)反應(yīng)（催化）的特性，通過(guò)測(cè)定被加速化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來(lái)計(jì)算酶活性濃度的高低。,酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),酶促反應(yīng),酶促反應(yīng)進(jìn)程,一、酶活性測(cè)定,（一）定時(shí)法測(cè)定酶活性,終點(diǎn)法是在酶促反應(yīng)平衡期（S或P不變）任何一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，故不需終止反應(yīng)。,1直接法,是在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導(dǎo)率、粘度等，從而計(jì)算出酶活性濃度。,2間接法,在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測(cè)酶反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)。,連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法。,（二）連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性,酶偶聯(lián)反應(yīng),ABCD,酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性濃度的酶,Ei指示酶,Ea輔助酶,Ex,Ei,Ea,工具酶,L-丙氨酸-酮戊二酸-丙酮酸L-谷氨酸,丙酮酸NADHH+乳酸NAD+,ALT（樣品）,LD（試劑）,酶耦聯(lián)法測(cè)定ALT,340nmA/min,-酮酸標(biāo)本中,GLDH標(biāo)本中,試劑1,試劑2,酶耦聯(lián)法測(cè)定舉例,(三)干擾因素,1其他酶和物質(zhì)的干擾2酶的污染3非酶反應(yīng)4分析容器的污染5沉淀形成,（四）血清酶活性濃度測(cè)定條件的優(yōu)化(1)方法選擇(2)儀器和設(shè)備(3)試劑(4)儀器參數(shù)的設(shè)置1方法類(lèi)型2波長(zhǎng)3樣品量與試劑量4.稀釋水量5反應(yīng)時(shí)間6孵育時(shí)間7.延遲時(shí)間8.監(jiān)測(cè)時(shí)間9.試劑吸光度上、下限10.底物耗盡限額11.線(xiàn)性度12.試劑空白速率13.線(xiàn)性范圍14.計(jì)算因子F值(五)部分分析前因素對(duì)酶活性測(cè)定的干擾1溶血2抗凝劑3標(biāo)本儲(chǔ)存溫度,（六）酶活性濃度的單位1.酶活性單位（1）慣用單位（2）國(guó)際單位-在特定的條件下，一分鐘內(nèi)使底物轉(zhuǎn)變一微摩爾的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。（3）Katal單位-在規(guī)定條件下，每秒鐘催化轉(zhuǎn)化一摩爾底物的酶量。1katal60106U,2.酶活性濃度單位以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。（1）表示方法-UL（2）酶活性濃度單位的計(jì)算-用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定時(shí)，根據(jù)摩爾消光系數(shù)計(jì)算。,3.參考值和正常上限倍數(shù)的應(yīng)用（1）參考區(qū)間（2）正常上限倍數(shù)的應(yīng)用正常上限(upperlimitsofnormal，ULN)倍數(shù)作為酶活性濃度的表示法，就是測(cè)定值除以正常上限值。,（七）系數(shù)K值的計(jì)算與應(yīng)用,1.系數(shù)K值的意義與設(shè)置2.系數(shù)K值的類(lèi)型與計(jì)算,（八）臨床酶學(xué)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化,1.標(biāo)準(zhǔn)化途徑1使用推薦方法和參考方法2使用公認(rèn)的酶校正物或酶參考物2.酶活性濃度測(cè)定的參考系統(tǒng)1建立原級(jí)參考方法2制備原級(jí)參考物3建立參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò),（一）測(cè)定原理（二）免疫化學(xué)測(cè)定的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)主要有：靈敏度高特異性高能用于一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白特別適用于同工酶的測(cè)定局限性主要有：制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清較困難測(cè)定步驟多，操作繁瑣測(cè)定成本高,二、酶質(zhì)量測(cè)定,三、同工酶檢測(cè),(一)電泳法-瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、毛細(xì)管電泳用電泳法進(jìn)行同工酶分析時(shí)，如顯示的區(qū)帶數(shù)與同工酶數(shù)不一致時(shí)，要特別注意巨分子酶的存在。(二)層析法,血清LD電泳圖譜分析,正常和病理狀況時(shí)血清CK同工酶譜,(三)免疫分析法免疫抑制法利用同工酶的一種亞基與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，酶活性受到抑制，測(cè)定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化，可以計(jì)算出該型同工酶的活性。不加抗CK-MM血清時(shí)樣品的CK活性：CK-MM和CK-MB活性；加入抗CK-MM血清時(shí)樣品的CK活性：50CK-MB的活性；加入抗CK-MM血清時(shí)樣品的CK活性2：CK-MB活性；所測(cè)CK-MM和CK-MB之總活性CK-MB活性CK-MM活性。,(四)動(dòng)力學(xué)分析法1底物特異性分析法2抑制劑分析法3pH分析法4熱失活分析法(五)蛋白酶水解法,第三節(jié)常用酶及同工酶測(cè)定的臨床應(yīng)用,一、血清酶,血清酶活性升高的原因：組織器官受損造成細(xì)胞破壞或細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的某些酶大量釋放入血；細(xì)胞的轉(zhuǎn)換率增高或細(xì)胞的增殖加快，其特異的標(biāo)志酶釋放入血；細(xì)胞內(nèi)酶的合成或誘導(dǎo)增強(qiáng)；酶的清除受阻。,1、血清酶的來(lái)源（1）血漿特異酶（2）非血漿特異酶外分泌酶細(xì)胞酶2、血清酶的去路（1）血清酶的半壽期（2）血清酶的失活和排泄,（一）血清酶的來(lái)源與去路,（二）血清酶的生理差異1性別2年齡3進(jìn)食4運(yùn)動(dòng)5妊娠6其他,常用的酶譜：(1)心肌酶譜-AST、LD、CK、CK-MB、CK-MB亞型或CK-MM亞型(2)肌酶譜-LD、AST及其同工酶、CK-MM亞型(3)肝酶譜-ALT、LD、-GT、ALP、ChE、MAO(4)腫瘤酶譜-ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS(5)胰酶譜-AMY及其同工酶、LPS、彈力蛋白酶-1、磷脂酶A2,（三）血清酶的臨床應(yīng)用,二、尿液酶三、漿膜腔積液酶四、腦脊液酶,五、同工酶的診斷價(jià)值,LD同工酶心肌梗死、肝功能損傷和惡性腫瘤CK同工酶心肌梗死、肌肉疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病AST同工酶肝臟、心肌等細(xì)胞損傷程度的判斷GP同工酶急性心肌梗死ARS同工酶膀胱癌ALD同工酶肝臟疾病、心肌梗死、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤-GT同工酶肝臟占位性病變AMS同工酶急性胰腺炎、腮腺炎ALP同工酶肝膽疾病、骨骼疾病ACP同工酶前列腺疾病GST同工酶肝臟疾病、肺癌,1、轉(zhuǎn)氨酶及其同工酶DeRitis比值（ASTALT）對(duì)于急、慢性肝炎的診斷、鑒別診斷以及判斷轉(zhuǎn)歸也有特別價(jià)值。急性肝炎時(shí)比值1，肝硬化時(shí)比值2，肝癌時(shí)比值3?！懊改懛蛛x”現(xiàn)象重癥肝炎時(shí)由于大量肝細(xì)胞壞死，血中ALT逐漸下降，而膽紅素卻進(jìn)行性升高，常是肝壞死的前兆。,2、-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶-GT同工酶分為-GT1、-GT2、-GT3和-GT4四種，正常人只見(jiàn)-GT2和-GT3。重癥肝膽疾病和肝癌時(shí)常有-GT1出現(xiàn)，乙醇性肝壞死和膽總管結(jié)石時(shí)常有-GT2增加，-GT4與膽紅素增高密切相關(guān)。,3、肌酸激酶及其同工酶和亞型,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在3種同工酶，即CK-BB(CK1)，CK-MB(CK2)和CK-MM(CK3)。在細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)還存在另一CK同工酶，即所謂線(xiàn)粒體CK(CK-Mt)，也稱(chēng)CK4。CK-MM亞型測(cè)定對(duì)早期A(yíng)MI的檢出更為敏感，一般以CK-MM3CK-MMl10作為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)CK-MB2亞型在A(yíng)MI早期診斷和判斷有無(wú)再灌注上有很高的靈敏度和特異性。一般CK-MB219UL或CK-MB2CK-MB115可作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。,4、乳酸脫氫酶及其同工酶,AMI時(shí)，LD由于分子量較大，在常用心肌酶中升高最遲，通常在梗死8-18h升高，48-144h達(dá)峰值，可顯著升高(5ULN)，因其半壽期較長(zhǎng)，增高持續(xù)時(shí)間可達(dá)5-10d，此時(shí)其他酶已恢復(fù)正常，在亞急性心肌梗死診斷上有一定價(jià)值。測(cè)定血清及胸腹水中LD含量常用來(lái)鑒別其為漏出液抑或滲出液，若胸水LD血清LD0.6、腹水LD血清LD0.4為滲出液，反之為漏出液。骨骼肌和肝細(xì)胞損傷時(shí)常出現(xiàn)LD5LD4。急性肝炎時(shí)LD1和LD2相對(duì)下降，LD5升高；慢性肝炎時(shí)LD5升高，且LDlLD3；肝硬化時(shí)僅表現(xiàn)LD2下降和LD5升高；肝癌時(shí)LD5升高，但LD1LD3。惡性腫瘤如轉(zhuǎn)移到肝臟往往伴有LD4、LD5升高。,5、堿性磷酸酶及其同工酶,人體各組織ALP同工酶可分為3大類(lèi)，即胎盤(pán)ALP、腸ALP和肝骨腎ALP同工酶。肝硬化、膽石癥和腫瘤引起的膽汁淤積，ALP增高達(dá)ULN的520倍。90以上的肝外膽道阻塞患者血清ALP升高，升高的程度常和阻塞程度及病程成正比。胃腸道腫瘤；肺癌等惡性腫瘤時(shí)出現(xiàn)類(lèi)腸型ALP，稱(chēng)為Kasahara同工酶和類(lèi)胎盤(pán)同工酶稱(chēng)為Regan或Nagao同工酶。,6、酸性磷酸酶及其同工酶,ACP同工酶分前列腺ACP(PAP)和非前列腺ACP(如紅細(xì)胞ACP、溶酶體ACP、破骨細(xì)胞或吞噬細(xì)胞ACP等)兩大類(lèi)，在前列腺中含有豐富的PAP。ACP及其同工酶測(cè)定主要用于診斷前列腺癌。,7、淀粉酶及其同工酶,根據(jù)臟器來(lái)源分為胰型同工酶(P-AMY)和唾液型同工酶(S-AMY)，兩者再可用醋酸纖維薄膜電泳進(jìn)一步分成Pl、P2、P3、S1、S2和S3等同工酶亞型。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)帶命名為17，其中1、2、4、6四條區(qū)帶屬于P-AMY，3、5、7三條區(qū)帶屬于S-AMY。血清中有時(shí)可出現(xiàn)巨淀粉酶，該酶可能是由S-AMY與IgG或IgA等聚合而成。人體胰腺和腮腺組織損傷時(shí)，血清和尿中的總AMY可顯著增高，尿AMY約于發(fā)病后12-24h開(kāi)始升高，下降也比血清AMY慢，因此在急性胰腺炎后期測(cè)定尿AMY更有價(jià)值。,8、脂肪酶,血清中LPS主要來(lái)自胰腺，少量來(lái)自胃腸粘膜。由于血清LPS在急性胰腺炎時(shí)活性升高的時(shí)間早，上升的幅度大，持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，故其診斷價(jià)值優(yōu)于A(yíng)MY。凡血清AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者