液相色譜教程(三)相色譜實(shí)驗(yàn)操作.ppt

液相色譜教程(三)液相色譜實(shí)驗(yàn)操作,Waters中國(guó)有限公司培訓(xùn)中心,啟動(dòng)液相色譜儀器的流程,開(kāi)啟HPLC系統(tǒng)各個(gè)設(shè)備的電源打開(kāi)泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器電源，待設(shè)備通過(guò)自檢后，打開(kāi)計(jì)算機(jī)，啟動(dòng)色譜管理軟件準(zhǔn)備流動(dòng)相過(guò)濾,脫氣色譜泵排氣用新配制的流動(dòng)相灌注泵,啟動(dòng)液相色譜儀器的流程,用準(zhǔn)備好的流動(dòng)相平衡色譜系統(tǒng)可在泵的控制面板上設(shè)定流速參數(shù)(155泵需在軟件控制下操作)系統(tǒng)大約需平衡0.5-1小時(shí)方能穩(wěn)定工作準(zhǔn)備樣品用流動(dòng)相溶樣或重組樣品編制儀器方法,開(kāi)始實(shí)驗(yàn),液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求,色譜柱對(duì)流動(dòng)相的要求過(guò)濾除去微粒純度的要求超純水，或用KMnO4處理過(guò)的雙蒸水有機(jī)溶劑：色譜純(溶劑中的雜質(zhì)含量盡可能低)，并與填料相匹配緩沖液的pH值，在填料的允許范圍(一般在pH2-8)內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度不要太高(100mM)流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度調(diào)整有機(jī)溶劑和水的比例最好用流動(dòng)相溶樣,液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求,液相色譜儀器對(duì)流動(dòng)相的要求與檢測(cè)器匹配脫氣避免用含鹵素離子的緩沖鹽（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度防止細(xì)菌的生長(zhǎng),流動(dòng)相的脫氣,流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液量均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化,流動(dòng)相脫氣的方法,加熱簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波振蕩簡(jiǎn)單，但效果不夠理想；超聲時(shí)間不要太長(zhǎng)(1分鐘左右即可)通惰性氣體（一般用氦氣）可保持在線連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度在線脫氣機(jī)（in-linedegasser)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度,流動(dòng)相的保存,有機(jī)溶劑流動(dòng)相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動(dòng)相:當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過(guò)3天防止微生物生長(zhǎng)有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相:低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超純水,測(cè)試條件水樣:40mltraceenrichment2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水100%乙腈波長(zhǎng):254nm,保存于棕色玻璃瓶中的超純水,測(cè)試條件水樣:40mltraceenrichment2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水100%乙腈波長(zhǎng):254nm,色譜泵的排氣操作,色譜泵實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)先確認(rèn)泵頭內(nèi)沒(méi)有氣體，如有氣體要按以下步驟排氣：將泵入口管吸濾頭放入脫過(guò)氣的流動(dòng)相中打開(kāi)泵及在線脫氣機(jī)電源開(kāi)關(guān)將排液閥打開(kāi)，或斷開(kāi)與色譜柱連接的管路設(shè)置流速到6-9ml/min,排液閥出口有液流連續(xù)流出必要時(shí)(600泵)用10ml注射器從泵入口注入流動(dòng)相對(duì)于600,2695四元梯度泵,分別對(duì)所用各路溶劑進(jìn)行排氣操作停止泵流速,關(guān)閉排液閥,恢復(fù)斷開(kāi)的管路,備用注:泵排氣后,應(yīng)輸液穩(wěn)定(系統(tǒng)壓力脈動(dòng)小,一般在幾十Psi以?xún)?nèi)),否則,需重做排氣操作,Waters515泵的前面板,電源開(kāi)關(guān)柱塞桿清洗孔排液閥,Waters600泵的前面板,柱塞桿清洗孔,電源開(kāi)關(guān),排液閥,泵控制器,泵體,泵灌注閥,Waters2695分離單元,2695排氣操作示意圖,面板操作:打開(kāi)狀態(tài)(Statas)畫(huà)面按右下角DirectFunction功能鍵選DryPime或WetPrime命令選OK即可進(jìn)行泵的排氣注:當(dāng)流路中充滿(mǎn)空氣時(shí),按圖示做DryPrime若只是更新流動(dòng)相時(shí),只須作WetPrime,關(guān)于色譜系統(tǒng)的反壓,什么是反壓(backpressure)流動(dòng)相流經(jīng)管路及色譜柱時(shí)會(huì)有阻力,即所謂的反壓,又稱(chēng)系統(tǒng)反壓或系統(tǒng)壓力Waters習(xí)慣用的壓力單位是Psi(磅/平方英吋)其它單位有:Bar,Mpa影響系統(tǒng)反壓的主要因素:流動(dòng)相的溶劑組成溫度流速,反壓與溶劑組成的關(guān)系,流動(dòng)相的粘度是產(chǎn)生反壓的主要原因有機(jī)溶劑水的粘度隨組成而改變其壓力隨組成變化如下圖所示,反壓與流速的關(guān)系,流速對(duì)反壓的影響是線性關(guān)系流速增加，反壓亦增大下圖的實(shí)驗(yàn)條件：2.130mmSymmetryC18柱,20,反壓與溫度的關(guān)系,溫度對(duì)反壓的影響是反比關(guān)系溫度升高,反壓降低,對(duì)某些流動(dòng)相的影響更大一些,影響系統(tǒng)反壓的其它因素,反壓與色譜柱長(zhǎng)度成正比反壓與填料顆粒度的平方成反比2.5m填料比3.5m填料反壓高反壓與管路直徑的四次方成反比(1/D4)反壓與管路的長(zhǎng)度成正比,色譜泵的運(yùn)行,排氣后的色譜泵即可用于實(shí)驗(yàn)運(yùn)行注意排氣后，先設(shè)流速為0恢復(fù)排氣時(shí)斷開(kāi)的部分，如:進(jìn)樣器、色譜柱如需要，恢復(fù)排氣時(shí)斷開(kāi)的控制線根據(jù)色譜柱的不同，逐漸提高流速到設(shè)定值若使用緩沖鹽流動(dòng)相,用前和用后均需用水過(guò)渡(包括排氣操作),色譜泵的維護(hù)保養(yǎng),流動(dòng)相要過(guò)濾常用緩沖液時(shí)，停泵前要用水清洗泵頭，并用水沖洗柱塞桿清洗孔關(guān)閉排液閥時(shí)，不要太用力擰緊，以不滲液為準(zhǔn)更換流動(dòng)相時(shí)，要保證兩種溶劑的互溶性,如不互溶，要用一種中間溶劑過(guò)渡色譜泵在停用時(shí),應(yīng)先用水洗去緩沖鹽,然后用純甲醇充滿(mǎn)泵頭及管路,并保存在純甲醇中,液相色譜系統(tǒng)的清洗與鈍化,色譜泵吸濾頭,進(jìn)出口閥及管路(包括進(jìn)樣器和檢測(cè)池)若被污染,應(yīng)作清洗和鈍化處理一般采用30磷酸水溶液作為清洗劑，用6M硝酸作為鈍化劑，先清洗再鈍化清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內(nèi)的污垢鈍化的目的是使不銹鋼管路的內(nèi)表面形成光滑均勻的氧化膜,色譜泵及系統(tǒng)的清洗,清洗液用30%磷酸水溶液30%磷酸配制:取85%濃磷酸35ml與65ml水混勻清洗步驟如下:取下色譜柱，用兩通(Union)連接進(jìn)樣器和檢測(cè)器用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用30%磷酸清洗液洗系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過(guò)渡，浸潤(rùn)泵頭及管路，備用,色譜泵及系統(tǒng)的鈍化,鈍化液用6M硝酸水溶液6M硝酸的配制:取濃硝酸40ml與60ml水混勻鈍化步驟如下:在清洗步驟完成后進(jìn)行鈍化處理確認(rèn)清洗用的磷酸已基本洗凈用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用6M硝酸水溶液鈍化系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過(guò)渡，浸潤(rùn)泵頭及管路，備用,實(shí)驗(yàn)樣品的制備,標(biāo)樣和樣品標(biāo)樣:又稱(chēng)對(duì)照品,它作為液相色譜定性和定量分析的參考標(biāo)準(zhǔn)物,一般是純度較高的純物質(zhì)樣品:待測(cè)物,一般是成分復(fù)雜的混合物液相色譜對(duì)樣品(包括標(biāo)樣)制備的要求:必須能溶于流動(dòng)相如樣品的溶劑不是流動(dòng)相,一定要用流動(dòng)相試溶解度,以免在進(jìn)樣時(shí)樣品在流動(dòng)相中析出,堵塞管路和色譜柱樣品溶液要過(guò)濾除去微粒及雜質(zhì)了解樣品對(duì)色譜柱的基質(zhì)/填料是否有破壞作用,復(fù)雜樣品的預(yù)處理,樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于保護(hù)色譜柱及儀器,樣品預(yù)處理的重要性,是影響實(shí)驗(yàn)成敗的決定性步驟占樣品分析時(shí)間的比例最大樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)多于色譜分離的時(shí)間占分析消耗總成本的比重最大消耗大量的溶劑及其它化學(xué)品對(duì)分析結(jié)果的重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性影響最大的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素,樣品預(yù)處理常用的方法,高速離心取上清液過(guò)濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-液萃取固相提取(SolidPhaseExtract,SPE)Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它,去除微粒的方法,過(guò)濾過(guò)濾膜/過(guò)濾裝置有機(jī)濾膜(0.5m)/水溶性濾膜(0.45m)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡(jiǎn)單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000rpm,超濾,機(jī)理超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽,選擇性沉淀,常用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，高氯酸鹽50%硫酸銨10%TCA(三氯乙酸鈉),樣品衍生,提高檢測(cè)的靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測(cè)的靈敏度增加熒光基團(tuán)以便使用高靈敏度熒光檢測(cè)器改變分離的選擇性改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子柱前衍生氨基酸分析,AccQ-Tag衍生法,濃縮樣品,目的：富集微量或痕量組份濃縮樣品的方法萃取/吹干沉淀/再溶解色譜法固相提取Oasis小柱Sep-Pak小柱,OasisHLB固相提取小柱,親水-親脂平衡共聚物,“親水”使填料具有水可浸潤(rùn)性質(zhì)降低與水的接觸角,“親脂”提供對(duì)被分析物質(zhì)的反相保留能力,這是適合于分析眾多基質(zhì)中大多數(shù)樣品的通用操作步驟建議首先使用這種通用的操作步驟如果需要進(jìn)一步降低干擾物的影響，可使用二維SPE方法注:此方法于規(guī)格為3cc,60mg的OasisHLB小柱上開(kāi)發(fā),樣品預(yù)處理的通用SPE方法,SPE處理的效果,進(jìn)樣器的使用,進(jìn)樣器的種類(lèi):手動(dòng)進(jìn)樣器7725i自動(dòng)進(jìn)樣器717Plus，2695樣品管理系統(tǒng)進(jìn)樣器與系統(tǒng)的連接：進(jìn)樣器的入口與色譜泵的出口相連進(jìn)樣器的出口與色譜柱的入口相連要求：出入口方向不能接錯(cuò)，接頭不能留有空隙進(jìn)樣器的連接管路：出口管路一定要用細(xì)管(內(nèi)徑0.009),長(zhǎng)度要短,盡量減少譜帶擴(kuò)展,手動(dòng)進(jìn)樣器的使用,7725i手動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式:固定體積進(jìn)樣:進(jìn)樣量取決于Loop的體積可變體積進(jìn)樣:進(jìn)樣量由微量注射器量取注意:固定體積進(jìn)樣需要用超過(guò)Loop體積5-10倍的樣品量進(jìn)樣,以保證進(jìn)樣濃度不被稀釋可變體積進(jìn)樣在注射器注入樣品后,應(yīng)盡快將進(jìn)樣器扳至Inject位置,以避免樣品在Loop中的擴(kuò)散進(jìn)樣器的清洗:每次進(jìn)樣前應(yīng)將微量注射器清洗干凈,防止樣品間交叉污染,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,自動(dòng)進(jìn)樣器的使用,自動(dòng)進(jìn)樣器(717Plus和2695樣品管理系統(tǒng)):樣品瓶位置和進(jìn)樣量由軟件設(shè)定注意:樣品瓶中應(yīng)有超過(guò)13瓶高度的樣品量使用內(nèi)襯管(Insert)時(shí)應(yīng)設(shè)定針高度為2mm(2695)或75%高度(717Plus)進(jìn)樣器的清洗:進(jìn)樣針是流路的組成部分,運(yùn)行中一直由流動(dòng)相清洗進(jìn)樣針外部由軟件控制在每次進(jìn)樣前用洗針液清洗若注射器內(nèi)出現(xiàn)氣泡，用面板操作的PurgeInject功能清除之,自動(dòng)進(jìn)樣器的洗針液,注意洗針溶劑瓶(內(nèi)放綠色塑料管)不要放在儀器的上部，應(yīng)放于與儀器同一水平面的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,洗針溶劑根據(jù)流動(dòng)相的不同應(yīng)有不同：,檢測(cè)器的啟動(dòng)操作,連通流路：色譜柱出口接檢測(cè)器入口注意接頭不要留有空隙連接管路要用細(xì)管(0.009)檢測(cè)器出口用適當(dāng)?shù)墓苈?內(nèi)徑,長(zhǎng)度)通向廢液瓶連通數(shù)據(jù)線路:IEEE電纜(對(duì)大多數(shù)檢測(cè)器)與軟件busLAC/E卡連接手動(dòng)進(jìn)樣器的啟動(dòng)信號(hào)線與檢測(cè)器背板上的InjectStart接口連接開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)后,需待檢測(cè)器通過(guò)自檢后,才能被軟件控制(約需5-10分鐘)通流動(dòng)相平衡至少30分鐘后才能正常工作,Waters2487檢測(cè)器,2487的顯示屏幕,通道,吸光度,燈開(kāi)/關(guān),波長(zhǎng),靈敏度,下一畫(huà)面,運(yùn)行時(shí)間(分),自控/遙控,診斷開(kāi)/關(guān),鍵盤(pán)鎖開(kāi)/關(guān),單/雙波長(zhǎng),Shift開(kāi)/關(guān),AUFS(AbsorbanceUnitFullScale):滿(mǎn)量程吸光度單位,2487的面板及操作,回車(chē)鍵,分屏顯示鍵,選項(xiàng)移動(dòng)鍵,主屏幕,方法調(diào)用，A/B通道切換,設(shè)置及診斷,單/雙波長(zhǎng)，自動(dòng)調(diào)零,運(yùn)行/停止鍵,第二功能鍵,監(jiān)視色譜圖,屏幕對(duì)比度,Waters2996PDA檢測(cè)器,PDA(PhotoDiodeArray):光電二極管矩陣,由軟件設(shè)定檢測(cè)器參數(shù),只需設(shè)定如下參數(shù)即可采集數(shù)據(jù)波長(zhǎng)范圍分辨率每秒采集的光譜數(shù)操作極為簡(jiǎn)便不需費(fèi)神選擇參比波長(zhǎng)及其帶寬,Waters2414示差折光檢測(cè)器,2414的顯示屏幕,沖洗參比池,折射率,極性,RIU量程,檢測(cè)器溫度,下一畫(huà)面,運(yùn)行時(shí)間(分),自控/遙控,鍵盤(pán)鎖開(kāi)/關(guān),模式,Shift,2414的面板及操作,回車(chē)鍵,屏幕對(duì)比度,選項(xiàng)移動(dòng)鍵,主屏幕,方法調(diào)用，溫度設(shè)置,自動(dòng)調(diào)零,運(yùn)行/停止鍵,第二功能鍵,監(jiān)視色譜圖,沖洗參比池,設(shè)置及診斷,下一頁(yè),2414檢測(cè)器的日常操作,設(shè)定檢測(cè)器內(nèi)、外(如有柱溫箱)溫度以5ml/min的流速“purge”參比池五分鐘不接色譜柱！參數(shù)設(shè)置按文獻(xiàn)值或?qū)嶒?yàn)決定至少需要2小時(shí)以上的平衡時(shí)間通常檢測(cè)器可以在白天結(jié)束工作后不關(guān)機(jī)，保持0.1到0.5ml/min的流速循環(huán)沖洗樣品池和參比池,可節(jié)省第二天的平衡時(shí)間,使用示差檢測(cè)器的注意事項(xiàng),不能做梯度實(shí)驗(yàn)最大的池耐壓是100psi注意保持出口管路的暢通流速范圍是0.1-10ml/min此種類(lèi)型檢測(cè)器是壓力敏感和溫度敏感型檢測(cè)器注意保持泵壓力的平穩(wěn)注意環(huán)境溫度的恒定,Waters2475熒光檢測(cè)器,2475檢測(cè)器的特點(diǎn),可調(diào)波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器雙掃描在掃描模式下(Scan)發(fā)射波長(zhǎng)及激發(fā)波長(zhǎng)均可掃描高靈敏度水的RAMAN峰S/N大于200可編程時(shí)間-波長(zhǎng)時(shí)間-增益由RS232串行口或網(wǎng)線與計(jì)算機(jī)相連,2475的主顯示屏,發(fā)射/能量,燈開(kāi)/關(guān),下一頁(yè),運(yùn)行時(shí)間(分),面板/軟件控制,鍵盤(pán)鎖/開(kāi),Shift開(kāi)/關(guān),單/多波長(zhǎng),通道選擇,增益,波長(zhǎng),診斷鍵開(kāi)/關(guān),靈敏度,2475的面板及操作,回車(chē)鍵,分屏顯示鍵,選項(xiàng)移動(dòng)鍵,主屏幕,方法調(diào)用，通道切換,設(shè)置診斷,自動(dòng)調(diào)零,運(yùn)行/停止鍵,第二功能鍵,監(jiān)視色譜圖,開(kāi)關(guān)燈,屏幕亮度調(diào)節(jié),光譜掃描,2475熒光檢測(cè)器的掃描功能,掃描功能由面板功能執(zhí)行Empower英文版亦能由軟件執(zhí)行,熒光檢測(cè)器使用注意事項(xiàng),不是所有化合物都有熒光