液相色譜基礎(chǔ)知識

液相色譜基礎(chǔ)知識,關(guān)于色譜,色譜是一種分離工具，而不是傳統(tǒng)意義上的分析儀器常見的分離方式：蒸餾、離心、電泳、過濾、超濾等等,色譜是其中一種分離工具,色譜法簡介,色譜法（Chromatography）溯源俄國科學(xué)加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法并見諸于俄文的文獻(xiàn)1906年正式命名（見諸文獻(xiàn)）色譜法；Chromatography50年代開始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代,色譜的發(fā)明人,俄國科學(xué)家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻(xiàn),一、色譜起源,經(jīng)典液相色譜,色譜分離的機(jī)理,分離是一個(gè)物理的過程,流動相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）樣品（溶解于流動相中的溶質(zhì)）,什么是液相色譜,氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相,什么是高效液相色譜,HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)在技術(shù)，理論及應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段,液相色譜的基本流程圖,流動相,泵,色譜柱,檢測器,泵輸液,分離,檢測,記錄,進(jìn)樣閥,進(jìn)樣,HPLC的儀器配置,色譜泵,自動進(jìn)樣器,色譜柱及柱溫箱,檢測器,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),溶劑,HPLC的應(yīng)用,在食品研究中的分析應(yīng)用食品中的天然成分碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機(jī)酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素農(nóng)藥和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS和亞硝酸,HPLC的應(yīng)用,在獸藥研究中分析應(yīng)用在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用藥物分析有USP、BP、CP等標(biāo)準(zhǔn)常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡愃幬镅芯恐械膽?yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學(xué)研究。,HPLC的應(yīng)用,在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類)在精細(xì)化工分析中的應(yīng)用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品在無機(jī)離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析,HPLC的應(yīng)用,在公安、刑警破案工作需要毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類和胺類的檢測*2004年獲悉，世界上化合物總數(shù)達(dá)到4700萬，其中絕大部分是有機(jī)化合物，而大約有70以上是不揮發(fā)的。對HPLC來說，只要被分析物質(zhì)在流動相溶劑（各種各樣中有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各業(yè)有著廣泛的應(yīng)用潛力。,高效液相色譜基本概念,色譜圖：HPLC圖形結(jié)果（Chromatogram）,色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間。,色譜峰,保留時(shí)間（分）,基線,峰高,峰寬,響應(yīng)值,液相色譜圖相關(guān)術(shù)語,色譜峰Peak色譜柱流出組分通過檢測器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線峰底PeakBase峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線峰高PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬PeakWidth在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離半（高）峰寬PeakWidthatHalfHeight通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離,液相色譜圖相關(guān)術(shù)語,峰面積PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差；StandardError0.607倍峰高處所對應(yīng)峰寬的一半拖尾峰TailingPeak后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰GhostPeak并非由試樣所產(chǎn)生的峰；亦稱假峰,液相色譜圖相關(guān)術(shù)語,基線Baseline在正常操作條件下，僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線基線飄移BaselineDrift基線隨時(shí)間定向的緩慢變化基線噪聲；NBaselineNoise由各種因素所引起的基線波動譜帶擴(kuò)展BandBroadening由于縱向擴(kuò)散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象,液相色譜圖相關(guān)術(shù)語,死時(shí)間，t0Deadtime不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間保留時(shí)間，tRRetentiontime組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間死體積，V0Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積保留體積，VRRetentionvolume組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積,液相色譜應(yīng)用：制備型液相色譜,分離及純化樣品是液相色譜原理的直接利用對分離及純化的要求化合物的穩(wěn)定性樣品的復(fù)雜性制備量的要求純度的要求，及純度的鑒定方法的安全性,液相色譜應(yīng)用：分析型液相色譜,定量分析主要基于與標(biāo)準(zhǔn)品的比較是其最大應(yīng)用領(lǐng)域定性分析；不是色譜的強(qiáng)項(xiàng)基于樣品的保留時(shí)間比較借助于和其聯(lián)用的紫外、質(zhì)譜或其他檢測器對定量及定性分析的要求靈敏度、精度及準(zhǔn)確度的要求樣品量的要求；復(fù)雜樣品的分析能力容易使用,色譜方法轉(zhuǎn)換,如果沒有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速,液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù),液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù)流動相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內(nèi)徑、長短流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測器參數(shù)：紫外檢測波長，靈敏度等溫度控制進(jìn)樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個(gè)具體的HPLC方法；亦稱色譜條件,評價(jià)液相色譜方法的標(biāo)準(zhǔn),問題：什么樣的分離結(jié)果是好的？分離度？靈敏度？,什么是色譜的分離度,分離度的公式：,R：分離程度的量度,影響分離度的因素：K、及N,分離度方程：K是容量因子，表達(dá)了被分離組分與柱填料之間作用的強(qiáng)弱是分離因子，描述兩個(gè)被分離組份分離的好壞程度，是化學(xué)因素N是理論塔板數(shù)，描述色譜峰譜帶展寬的程度,若N增加2倍或3倍,R會如何變化?,分離度方程解析：柱效項(xiàng),N理論塔板數(shù)：分離效率的量度,PW=.5,PW=2,色譜柱的柱效N,理論塔板數(shù)計(jì)算公式：Ws方法Wtan16切線法Wh5.54半峰高W3s93sW4s164sW5s255s,分離度與N的關(guān)系,分離度方程解析：分離因子項(xiàng),若=1.1or1.4，R會如何變化？,分離因子：峰分離程度的量度,分離因子：,定義：a=1時(shí)兩組分分不開，改變a的途徑改變固定相或改變流動相(組成)改變溫度改變樣品的本身性質(zhì),通過改變流動相組成改變，同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱,改變分離因子的例子,若=1,2,10or20,R會如何變化?,分離度方程解析：容量因子項(xiàng),K容量因子：保留能力的量度,V0,V1,V2,V3,時(shí)間0.5125,k值k項(xiàng)k對分離度影響00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95,容量因子k與分離度的關(guān)系,與R的關(guān)系,容量因子k與峰高的關(guān)系,改變k值的方法：調(diào)節(jié)流動相的極性（比例）、pH、離子強(qiáng)度等梯度淋洗,改變?nèi)萘恳蜃覭的例子,譜圖,、k及N如何控制分離度,對稱因子計(jì)算示意圖,色譜峰的對稱性對稱因子：a.拖尾因子b.不對稱因子,峰對稱因子計(jì)算公式,對稱因子(fs)：,式中：fs=0.951.05為正常峰fs0.95為前延峰fs1.05為拖尾峰,液相色譜原理更進(jìn)一步的探討,離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性,離子抑制色譜,離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離主要適用于弱酸性化合物的分離降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）內(nèi),離子抑制色譜實(shí)例,而在乙腈/水并且pH=7時(shí)，多數(shù)組份保留時(shí)間很短，無法完全分離。,離子抑制色譜的使用范圍,下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時(shí)用離子抑制法使用“離子對色譜法”,在高pH值下用離子抑制,色譜柱：D18-613(聚合物基質(zhì))，室溫流動相：乙腈/0.01MNH4OH+0.01MTBA流速：1.0ml/min檢測：UV-240nm樣品：巴比妥的衍生物巴比妥己瑣巴比