（精品）利用峰面積分析混合dna樣品

利用峰面積分析混合DNA樣品【關(guān)鍵詞】陰道混合物，強(qiáng)奸，DNA【中圖分類號】D9192；Q75【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B【文章編號】10079297200401005103在法醫(yī)DNA檢驗過程中，經(jīng)常會遇到多個體的混合樣本，如受害人和嫌疑人的混合樣品，幾個嫌疑人的混合樣品。熒光標(biāo)記自動分析STR系統(tǒng)，不僅能根據(jù)位點(diǎn)等位基因的個數(shù)判斷樣品是否為混合樣品，而且還能根據(jù)等位基因峰面積譜帶熒光總強(qiáng)度確定混合樣品中各組分的混合比例，推斷混合樣品中各組分的基因分型_1J。GILL等建立了利用峰面積分析混合樣品的方法_2。本文利用該法對一宗案件中的混合樣品進(jìn)行了分析，推斷混合樣品各組分的比例及各組分的基因分型。材料和方法2001年于中山某地發(fā)生一宗強(qiáng)奸案，送檢材料為事主血紗，嫌疑人1血紗，嫌疑人2血紗，以及在嫌疑人2住處提取的一根帶毛囊的陰毛上沾有少量分泌液，分別編為14號樣品。按CHELEX一100法提取DNA，采用AMPFISTRIDENTIFILER復(fù)合擴(kuò)增試劑盒美國ABI公司同時擴(kuò)增D8SL179、D21SLL、D7S820、F1P0、193S1358、THO1、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA等15個位點(diǎn)和性別位點(diǎn)AMELOGENIN，擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI310遺傳分析儀上進(jìn)行電泳分離，GENESCAN30軟件分析結(jié)果，GENOTYPERN25軟件進(jìn)行基因分型。結(jié)果一、樣品分型樣品分型結(jié)果見表1。表1樣品分型結(jié)果二、結(jié)果分析結(jié)果分析方法參照文獻(xiàn)2。一確定是否有混合樣品1根據(jù)譜帶數(shù)目。正常情況下進(jìn)行常染色體STR分型時，純合子應(yīng)檢出一條帶，雜合子檢出2條帶，混合樣品會出現(xiàn)譜帶數(shù)目增多。4號樣品在D8SL179等3個位點(diǎn)檢出4個等位基因表現(xiàn)為4條譜帶，在D21S11等6個位點(diǎn)檢出3條譜帶，提示該樣品為混合樣品。2等位基因峰面積的不對稱。理論上對于雜合子來說，兩個等位基因的峰面積應(yīng)大致相等，比例接近于1；而混合樣品由于等位基因的疊加，可能會出現(xiàn)不正常的雜合子現(xiàn)象，兩個等位基因的峰面積差異會增大。表2列出了混合比例為110、11、101時出現(xiàn)2個等位基因時峰面積的比例。4號樣品在TH01、D13S317、TPOX、D18S51、AMELOGENE等位點(diǎn)均檢出2條帶，類似雜合子，但2條帶的峰面積明顯不平衡見表3，同樣提示4號樣本為混合樣本，且為男女混合。二確定混合樣品中供體的數(shù)目樣品4所有位點(diǎn)出現(xiàn)的等位基因數(shù)最多為4個，提示供體數(shù)為2個。三確定混合樣品中各供體的基因型組合對于雜合子來說，兩個等位基因的峰面積應(yīng)大致相等，比例接近于1?；诖嗽?，分析者可以通過觀察到的峰面積來推斷可能的基因型組合和各組分的比例。對確定是二供體組成的混合樣本來說，分型結(jié)果可以表現(xiàn)為一帶型、二帶型、三帶型或四帶型。除一帶型外，其余各種表現(xiàn)均可提供基因型組合的信息。其中四帶型由于直觀地表現(xiàn)出2個供體的基因型，所以最易于通過其推斷2個供體的基因型組合及其比例。假設(shè)某一位點(diǎn)出現(xiàn)的4個等位基因依片段由小到大的順序定為A、B、C、D，觀察到的面積分別為PAA、PAB、PAC、PAD，定義MX為所有位點(diǎn)都接近相等，然后給出一個估計的混合比例MX，如果解釋正確的話，觀察值和期望值應(yīng)接近，這對任意基因型組合可用峰面積的剩余值EQ來檢驗，峰面積的剩余值EQPA觀察值一PA期望值，峰面積的剩余值越低，該基因型組合的可能性越高。以4號樣品的D8SL179位點(diǎn)為例，混合物中檢出10A、14B、15C、16D，據(jù)EQ值可推斷混合比例MXBCAD062，相反混合比例MXADBC038，其他的基因型組合如AB，CD不可能存在，因為EQ不可能接近零。表4列出了對出現(xiàn)4個等位基因的位點(diǎn)的分析，在列出某個位點(diǎn)的所有可能的基因型組合后，計算他們各自的EQ值，將EQ值最小的基因型組合作為推斷的基因型組合列入表4中。取表4計算出的MX的平均值036，并定義MX為所有位點(diǎn)都接近相等，計12算各位點(diǎn)的EQ值，見表4?？梢钥闯鋈X的平均值后，各位點(diǎn)的EQ值變化不大52分析出現(xiàn)3個等位基因比出現(xiàn)4個等位基因的模式復(fù)雜的多，因為排列組合更多，不過可應(yīng)用同樣原則。除部分位點(diǎn)可推斷基因型并推斷各組分比例，大部分出現(xiàn)3個等位基因的位點(diǎn)只能推斷各組分的多少而不能計算出具體數(shù)值。法律與醫(yī)學(xué)雜志2004年第LL卷第L期取表L計算出的MX的平均值036，并定義MX為昕有位點(diǎn)都接近相等，計算各位點(diǎn)推斷基因型組合的EQ值，表5列出EQ為最小值時的基因型組合。表2出現(xiàn)2個等位基因時峰面積的比例的分析表3出現(xiàn)2個等位基因的位點(diǎn)的分析表4出現(xiàn)4個等位基因的位點(diǎn)的分析表5出現(xiàn)3個等位基因的位點(diǎn)的分析律與醫(yī)學(xué)雜志2004年第11卷第1期表6混合樣品各組分基因型的推斷結(jié)果53從單個STR位點(diǎn)等位基因峰面積計算得出的混合物比例MX通?？蓱?yīng)用于所有位點(diǎn)，但當(dāng)某幾個位點(diǎn)可以推斷基因型組合并推斷混合物比例時，取MX的平均值去驗證各位點(diǎn)的EQ值顯得更為準(zhǔn)確。組分的比例越懸殊，基因型組合越易鑒別，比例越接近，可能的基因型組合越多，越難判斷。需注意的是峰面積值太低1000個單位時判型不準(zhǔn)確，應(yīng)通過增加或減少DNA樣品濃度、增加電泳上樣濃度、增加電泳進(jìn)樣時間等方法來提高峰面積及增加相應(yīng)峰的平衡，使峰面積更好地反映混合樣品中各組分的DNA比例。研究表明，當(dāng)混合比例為110和101時，較少組分的等位基因峰面積已接近與主要組分等位基因的“STUTTER”峰面積，所以混合比例過分懸殊時，分析應(yīng)多加注意。根據(jù)上述計算、分析推斷得出樣品4的混合物比例為036，基因型組合見表6，可以看出組分1有8個STR位點(diǎn)與嫌疑人1基因型相同，可達(dá)認(rèn)定。而組分二則有8個STR位點(diǎn)與事主基因型相同。在VWA位點(diǎn)中，1818、1417的基因型組合EQ值經(jīng)計算為00139，并非最小，可能由于等位基因擴(kuò)增不平衡所致。討論本文利用峰面積對兩組份的簡單混合斑進(jìn)行分析，方法簡單，貫穿推斷過程的是各等位基因的峰面積剩余值要接近于零，峰面積的剩余值越低，該基因型組合的可能性越高。1在確定樣本為兩組份的簡單混合物后，通過出現(xiàn)4個等位基因的位點(diǎn)的各峰的峰面積推斷可能的基因型組合和該組合的混合比例，取平均值。2利用此混合比例平均值對出現(xiàn)3個等位基因的位點(diǎn)和性別位點(diǎn)進(jìn)行分析，推斷出可能的基因型組合和性別組合。3將推斷出的各組分基因型與相關(guān)樣品基因型比對4需注意的是擴(kuò)增時混合物DNA的濃度應(yīng)控制在一個合適的范圍，使各等位基因擴(kuò)增盡量平衡，這樣結(jié)果更準(zhǔn)確。5應(yīng)盡可能多做幾個位點(diǎn)，位點(diǎn)越多，信息量越大，認(rèn)定的幾率也越大。6分析時盡量進(jìn)行盲分析，這樣可以保證分析的可重復(fù)性和科學(xué)性，可能會有個別位點(diǎn)出現(xiàn)錯誤，可將該位點(diǎn)去除或進(jìn)行修正。參考文獻(xiàn)1鄭秀芬，紀(jì)貴金，劉超，等二組份混合DNA樣品STR圖譜解釋中國法醫(yī)學(xué)雜志，2001，1542032072GILLP，SPARKERR，PI