蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,魏濤,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指：蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置。組成一個(gè)蛋白質(zhì)分子的多肽鏈的數(shù)目和多肽鏈中氨基酸的精確序列是蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的兩個(gè)重要方面。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。,一級(jí)結(jié)構(gòu) ( Primary Structure ),包括以下幾方面內(nèi)容： 多肽鏈的數(shù)目； 每條多肽鏈中氨基酸的種類、殘 基數(shù)目和排列次序； 鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的位置和數(shù)目。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的策略,從蛋白質(zhì)開始的蛋白質(zhì)序列分析 從DNA開始推蛋白質(zhì)氨基酸序列 質(zhì)譜法測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),從蛋白質(zhì)開始的蛋白質(zhì)序列分析,測(cè)定的基本戰(zhàn)略 測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)

2、的準(zhǔn)備工作 測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)的基本步驟,測(cè)定的基本策略,用兩種裂解肽鏈的方法,分別得到裂解肽段； 分離提純肽段,測(cè)出各個(gè)肽段的氨基酸序列； 對(duì)兩套肽段序列比較,找出重疊肽,確定各肽段位置,拼湊整個(gè)肽鏈的氨基酸排序。,測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備工作,對(duì)樣品純度的要求 97% 對(duì)蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 誤差10% 測(cè)定分子中多肽鏈的數(shù)目與種類 蛋白質(zhì)的氨基酸組成 蛋白質(zhì)的配基 蛋白質(zhì)的端基分析,測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)的基本步驟,測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈 測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成 分析多肽鏈的N末端和C末端 斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵 多肽鏈斷裂成肽段 測(cè)定各個(gè)多肽段的氨基酸順序 確定肽段在多肽鏈中的次

3、序 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置,測(cè)得相對(duì)分子質(zhì)量Mr 很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，如：滲透壓、擴(kuò)散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過濾、凝膠電泳等， 測(cè)定末端氨基酸數(shù)x X (m /Mr ) = n (蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目)（m為樣品質(zhì)量）,蛋白質(zhì)中多肽鏈數(shù)目的確定,蛋白質(zhì)中多肽鏈的拆分,變性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高濃度鹽溶液 如有二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過氧乙酸處理 凝膠過濾或電泳分離不同肽鏈,多肽鏈的拆分,氨基酸組成分析,酸水解： 堿水解： 甲基磺酸水解： 優(yōu)點(diǎn)： 不破壞色氨酸， 經(jīng)堿中和后可直接上機(jī)自動(dòng)分析 缺點(diǎn)：不能有碳水化合物存在 中和點(diǎn)不易掌握 計(jì)算出各種氨基酸分子

4、比 多肽鏈分子量,確定氨基酸組成,末端氨基酸分析,N末端氨基酸分析 丹黃酰氯法(DNS)： 優(yōu)點(diǎn)：可直接層析或電泳分離，熒光檢測(cè)定性 定量；靈敏度高(較二硝基氟苯 法高100倍) 二硝基氟苯 (DNFB or FDNB)法 ； 氨肽酶法；,+ HCI,弱堿性,+ DNS-氨基酸,酸水解,游離氨基酸,有機(jī)溶劑萃取,溶于水,定量 + 定性,確定N末端氨基酸,確定肽鏈數(shù)目,DNS-氨基酸,將肽鏈裂解成小片斷,要求：斷裂點(diǎn)較少，專一性較強(qiáng)、產(chǎn)率高 酶裂解法：常用的酶： 胰蛋白酶：僅斷裂Lys、Arg羧基形成的肽鍵（但） 糜蛋白酶：位點(diǎn)：Tyr、Phe、Trp羧基肽鍵 胃蛋白酶：位點(diǎn)：兩種疏水性氨基酸形

5、成的肽鍵 嗜熱菌蛋白酶：專一性較差 金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）： 梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶）： 化學(xué)裂解法： 溴化氰法：專一性斷裂蛋氨酸羧基形成的肽鍵,可得到合適大小的肽片斷,Cyanogen bromide(溴化氰法）,肽段氨基酸序列的測(cè)定,Edman降解法：一次可連續(xù)測(cè)定6070個(gè)氨基酸；程序復(fù)雜，工作量大； 酶降解法： 質(zhì)譜法：,Edman 降解法測(cè)定N-末端氨基酸,Edman reagent,PTC-多肽,少一個(gè)N-末端氨基酸的肽鏈,層析色譜鑒定,重復(fù),與DNS法聯(lián)合,肽片斷在多肽鏈中排列次序的確定 (見p179),多肽鏈中二硫鍵位置的確定,多肽鏈氨基酸系列的直接測(cè)定：最初于1954年由英國(guó)劍橋大學(xué)的Sanger實(shí)驗(yàn)室建立；現(xiàn)主要由編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序推導(dǎo). 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù) 美國(guó)生物醫(yī)學(xué)基金會(huì)的PIR (Protein Information Resource or Protein Identification Resource); 美國(guó)政府的Gen Bank (Gene Sequence Data Bank) 歐洲的EMBL (European Molecular Biology Labora