臨床微生物檢驗：實驗第7周

1、臨床微生物學檢驗第七個實驗周,實驗要求,掌握常見白假絲酵母菌的培養(yǎng)特點和鑒定方法 掌握溶脲脲原體、人型支原體的培養(yǎng)檢測方法 掌握外斐反應的原理操作和結果判定 熟悉冷凝集試驗的原理操作和結果判定,第一天實驗內容,1.真菌接種（1個沙氏平板/人） 2.支原體檢測：接種支原體液體培養(yǎng)基（UU、MH) （各1瓶/人） 3.冷凝集試驗（每組做） 4.外斐試驗（每組做）,1.MH、UU培養(yǎng)基 2.試管 3.外斐試劑 4.加樣槍和槍嘴 5.待檢血清 6.人血清+人紅細胞,試 劑,常用培養(yǎng)基：沙氏培養(yǎng)基(sabouraud) 培養(yǎng)基成分： 酵母浸膏、1%蛋白胨、4%葡萄糖、2%瓊脂、維生素B等、可加入抑制劑(

2、氯霉素、慶大或放線菌酮),假絲酵母菌的檢測,假絲酵母菌特點：菌體圓或卵圓形，革蘭陽性、著色不均勻，出芽方式繁殖，形成假菌絲；類酵母型菌落，菌落外觀類似細菌菌落，假菌絲由菌落向培養(yǎng)基深部生長，伸入培養(yǎng)基中。,白色念珠菌,白色念珠菌假菌絲深入培養(yǎng)基中,操作：1個沙氏平板/每人，分區(qū)劃線接種,支原體的檢測方法,標本采集： 分離培養(yǎng)： 溶脲脲原體培養(yǎng)基 基本成分：牛心消化液，20%小牛血清、酵母浸液 指 示 劑：酚紅 底 物：尿素 人型支原體培養(yǎng)基： 基本成分：同上 指 示 劑：同上 底 物：精氨酸,標本的采集 （1）非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物、中段尿。 （2）慢性前列腺炎患者前列腺液。 （3）原因

3、不明的不育癥患者精液。 （4）陰道炎、宮頸炎患者炎性分泌物 尿液標本離心取沉淀物接種。,支原體的分離培養(yǎng)：液體培養(yǎng)基接種（每人做） 模擬拭子洗脫-擠干-棄去棉支吸取100l液體標本接種于各種支原體液體培養(yǎng)基中（UU、MH）,冷凝集試驗的原理,原理：肺炎支原體感染患者的血清中常產生非特異性冷凝集素（其本質是IgM），在4 下，可與“O”型人紅細胞或自身紅細胞發(fā)生凝集，已凝集的紅細胞在37下，凝集現象消失。用于肺支感染的輔助診斷。,冷凝集試驗原理,抗原決定簇不能暴露，不能與抗體結合,混 合,暴露的抗原決定簇與抗體結合,混 合,37,4,37,冷凝集試驗原理,（1） 離心，分離血清。 （2）稀釋血清

4、：取試管8支，每管加NS 0.5ml,并于第1管中加入待檢血清0.5ml，混勻后吸出0.5ml，加入第2管中混勻，如此倍比稀釋至第7管，棄去0.5ml，最后1管不加血清作為陰性對照。 （3）每管加2%紅細胞懸液0.5ml，混勻，最終稀釋度為1:4、1:81:256。 （4）置4冰箱24h，觀察結果。,冷凝集試驗操作步驟,2%自身紅細胞制備： 1.洗滌紅細胞：吸去血清，用吸管攪拌血細胞，加入約1mlNS于試管中，混勻后，再用滴管吸取0.5 ml紅細胞懸液置于另一試管中。 2. 加入NS到紅細胞懸液中，NS量約2/3管高度，用滴管吹吸3-4次后，離心3000r/min 15分鐘。 3.棄去上清，重

5、復步驟2 一次。 4.取100l已洗滌紅細胞+4.9ml生理鹽水，混勻。,外斐試驗,原理： 用已知的變形桿菌OX19、OX2、OXk三種抗原與患者血清進行凝集試驗，檢測病人血清中有無相應的抗體。,1.準備3排試管，每排8支 2.另取一支粗試管（或小三角燒瓶、燒杯），加NS 2.7ml及血清0.3ml，混勻，即為1：10稀釋 3.取1：10稀釋血清，每管0.5ml分別放入各排第1支試管中 4.于粗試管中加入1.5ml NS，混勻，即為1：20稀釋 5.取1：20稀釋血清，每管0.5ml分別放入各排第2支試管中 6.以此類推,連續(xù)稀釋到第7支試管,第8支試管只加入0.5ml 生理鹽水 7.分別加入

6、OX19、 OX2、 Oxk診斷試劑0.5ml 8.振蕩，置37孵育過夜,方法,變形桿菌抗原 立克次體病 OX19 OX2 OXK 流行性斑疹傷寒 + + 鼠型斑疹傷寒 + + 恙蟲病 +,外斐反應,結果判定：出現肉眼可見凝集的最高血清稀釋度為抗體效價。 效價1：160有診斷意義,第二天實驗,白念珠菌革蘭染色和芽管形成試驗（每人做） 觀察UU和MH在液體培養(yǎng)基中的生長現象 觀察冷凝集試驗結果 觀察外斐反應結果,1.試管，玻片 2.革蘭染液 3.加樣槍和槍嘴、牙簽等 4.血清,試 劑,白色念珠菌,芽生孢子,芽生孢子,假菌絲,白念珠菌類酵母型菌落,白念珠菌類酵母型菌落,CHROMagar顯色平板,

7、白念珠菌類酵母型菌落（綠色）,芽管形成試驗（每人做）,1. 取200 l血清加入一無菌試管,2. 接種少量白念，充分混合， 37培養(yǎng),3. 每隔1 h取菌液涂片鏡檢，觀察有無芽管 形成,白念珠菌革蘭染色：每人做,芽管,液體培養(yǎng)基：變紅澄清透亮,+,-,生長緩慢 液體培養(yǎng)基：支原體生長后無明顯的混濁或沉淀，呈透明狀，有顏色改變。,支原體生長現象觀察,生長緩慢 在支原體固體培養(yǎng)基上菌落呈“油煎蛋”樣。,外斐結果判定： 注意觀察時先不要振蕩試管。先觀察對照管，對照管應混濁無凝集反應（菌體沉積于管底呈實心圓形）。再分別與對照管比較各試管凝集情況，根據各管液體透明度和凝集塊多少，以4、3、2、1（少量凝

8、集，菌體沉積呈圓環(huán)狀）符號來記錄。以出現肉眼可見的明顯凝集現象即2+（管底有凝集，但看不到菌體沉積形成的圓環(huán)或實心圓形）的血清最高稀釋倍數作為凝集效價。,以TPPA試驗結果為例來觀察外斐試驗結果 陽性：凝集顆粒在管底呈膜狀平鋪（+以上） 陰性：不出現凝集（管底出現灰白色實心圓塊或圓環(huán)）, ,底部凝集顆粒均勻膜狀平鋪,沒有紅色環(huán)或圓塊。,底部顆粒成紐扣狀聚集,底部顆粒形成小環(huán)狀,底部顆粒形成環(huán)狀明顯變大,變形桿菌抗原 立克次體病 OX19 OX2 OXK 流行性斑疹傷寒 + + 鼠型斑疹傷寒 + + 恙蟲病 +,外斐反應意義,結果判定：出現肉眼可見凝集（2+）的最高血清稀釋度為抗體效價。 效價1：160有診斷意義,冷凝集結果判定： 1.注意，從冰箱取出試管后，立即觀察結果。 2.觀察時先不要振蕩試管，先觀察試管底部紅細胞沉淀形狀，再輕搖試管。對照管內細胞應無凝集反應（表現為：紅細胞在試管底部出現實心圓形沉積）。根