植酸酶的分子生物學與基因工程.ppt

1、植酸酶的分子生物學與基物因工程,組員：張亞麗 耿紅汭 黃銀霞,植酶酸的分子生物學和基因工程,植酶酸 植酸酶介紹、用途、研究意義 植酶酸的分子生物學 1、微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì) 2、植酸酶基因 3、植酸酶的高級結(jié)構(gòu) 植酶酸的基因工程 1、在微生物中高效表達植酸酶基因 2、植酸酶的植物基因工程 3、植酸酶的熱穩(wěn)定性,植酶酸,植酶酸分子結(jié)構(gòu),植酸酶,植酸酶是一種能水解植酸的磷酸酶類。它能將植酸磷(六磷酸肌醇)降解為肌醇和無機磷酸。,植酸酶,此酶分為兩類：3植酸酶(EC3 1 3 8)和6一植酸酶(EC 3 1 26)。植酸酶廣泛存在于植物、動物和微生物中如玉米、小麥等高等植物，枯草芽孢桿菌、假

2、單孢桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物中。,植酸酶,植酸酶是一種能將飼料中植酸磷水解成無機磷和肌醇新型單胃動物飼料添加劑。,植酸酶,植酸酶可作為一種單胃動物的飼料添加劑，它的飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了確證。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60，糞便中磷排泄量減少40，同時還可降低植酸的抗營養(yǎng)作用。因此在飼料中添加植酸酶對提高畜禽業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要意義。,植酸酶,植酸酶作為一種能將飼料中植酸磷水解成無機磷和肌醇的新型單胃動物飼料添加劑，主要應用于豬、雞、鴨等單胃動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，應用范圍廣，需求量大。,植酸酶,它在歐洲使用較為廣泛，在我國

3、目前還沒有商品化的植酸酶生產(chǎn)，但是，考慮到我國的國情，植酸酶在我國的推廣使用有著極為重要的意義。,植酸酶植酸酶在我國的推廣使用所具有的重要意義 ：,植酸酶的使用能減輕江河、水域環(huán)境的磷污染。 我國江河、水域的富營養(yǎng)化污染極為嚴重如滇池的嚴重污染、近期發(fā)生的紅潮等。造成污染的關鍵因子是水體中的氮和磷過量。我國每年從畜禽糞便中排出的磷就達250萬t之多，是水體富營養(yǎng)化污染的罪魁禍首之一 。,植酸酶,形成高磷糞便的原因是飼料中的磷沒有得到有效利用。植酶酸的使用將使畜禽糞便中的磷排出量減少4075即我國將大大減輕江海、水域等環(huán)境的磷污染。,植酸酶,植酸酶能緩解我國磷資源匱乏、磷供應不足的局面。 我國是

4、一個缺磷大國，磷的產(chǎn)量不足需求量的十分之一，是僅亞于蛋白質(zhì)的第二大缺口飼料原料。,植酸酶,植酸酶的使用可代替飼料原料中所添加的無機磷(磷酸氫鈣)，全國每年少用磷酸氫鈣80120萬噸，從而可關停相應一批污染重的磷酸氫鈣生產(chǎn)廠，這對我國這種嚴重缺磷的國家而言有著更為重要的社會效益和生態(tài)效益。,植酸酶,植酸酶到目前為止并沒有得到廣泛的推廣應用 。,植酸酶主要原因是：,植酸酶在天然材料中的含量太低，難以大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本昂貴 植酸酶的抗逆性，尤其是熱穩(wěn)定性不能完全滿足飼料及飼料加工的要求,植酸酶,隨著基因工程技術的發(fā)展為這些問題的解決提供了一條有效的新途徑，植酸酶的基因工程研究已成為世界性的研究熱點。

5、,植酸酶的分子生物學,在1907年Suzuki等就在谷糠中發(fā)現(xiàn)了具有植酸酶活性的磷酸酶，接下來的較長的一個時期中研究都集中在植物和動物器官中的植酸酶第一個純化的植酸酶來源于麩皮，研究發(fā)現(xiàn)它雖然具有植酸酶活性但植酸并不是它的特異性底物。,植酸酶的分子生物學,來源于植物的植酸酶均屬于6-植酸酶最適pH范圍在5.07.5，不適合在單胃畜禽酸性的胃中起作用而且在植物中含量極低，因而從應用的角度出發(fā)60年代末植酸酶的研究轉(zhuǎn)向最適pH值為酸性、酶含量較高的微生物來源的植酸酶。,植酸酶的分子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),許多微生物都能產(chǎn)生植酸酶尤其在曲霉屑中。1968年Shieh等“發(fā)現(xiàn)所用的22株黑

6、曲霉菌中有21株能產(chǎn)生植酸酶。第一個被分離純化的植酸酶來源于Aspergitlusterreus No9A一1，它的最適pH值為4.5，最適酶反應溫度為70，此酶在pH 1.29.0均能穩(wěn)定維持其活性。,植酸酶的分子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),從此以后陸續(xù)從十幾種微生物中分離到植酸酶，如枯草芽孢桿菌、假單孢桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、酵母、曲霉等，并對酶的生理生化性質(zhì)進行了較深入的研究。其中來源與 Aficuum NRRL3135(A.niger var awamori)的植酸酶PHYA具有較好的耐熱性，在酸性條件下有較高的酶活性，被認為是目前最具有應用前景的飼用植酸酶，其酶學性質(zhì)研究也

7、較為深入。,植酸酶的分子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),這種來源的植酸酶PHYA屬于3一植酸酶是一種檐基化蛋白，糖基化含量為273，糖鏈中富含甘露糖，表觀分子量約為85kD。它的最適pH值為2.5和5.5、最適溫度為55，在37、pH2.5的條件下以植酸鈉為底物的Km值為50mmolCa2+、Fe2+對酶活性無影響，Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分別提高30和13,植酸酶的分子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),Cu2+、Zn2+、Fe2+和Cu+對酶活性有抑制作用，其中前兩種為非競爭性競爭，后兩種為競爭性抑制。另外，對一些來源于動物、植物的酸性磷酸酶有抑制作用的抑制劑如磷霉素對

8、它卻沒有抑制作用。,植酸酶的分子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),它對植酸酶有很高的底物特異性，酶的特異比活性為105 105 umg酶蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的終產(chǎn)物是單磷酸肌醇和無機正磷酸。,植酸酶的分子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),來源于A .niger 963植酸酶PHYA酶學性質(zhì)與來源于A.ficuum NRRI 3135(Aniger var awamori)的植酸酶PHYA基本相似，僅在最適pH上有所差異 前者最適pH值為1.8和5.7。來源于大腸桿菌的植酸酶的分子量為43kD，最適pH值為3.5，特異性活性為750 umg。,植酸酶的分

9、子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),來源于枯草芽孢桿菌的植酸酶的分子量為43kD，最適PH值為7.0。目前發(fā)現(xiàn)的絕大部分微生物來源的植酸酶分解植酸鹽形成的終產(chǎn)物均是單磷酸肌醇和無機正磷鹽，但1998年Mcchlzuki等從西方許旺酵母中分離出的植酸酶可將植酸鹽分解為肌醇和無機磷酸。,植酸酶的分子生物學微生物來源的植酸酶的酶學性質(zhì),另外一些微生物來源的酸性磷酸酶雖然最適底物不是植酸鹽，但也具有部分植酸酶的活性，如來源于黑曲霉 的最適PH2.5的酸性磷酸酶，來源于大腸桿菌的最適PH2.5的磷酸酶。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,到目前為止，共有十余個植酸酶編碼基因得到了分離克隆。幾乎所有分離得到

10、的植酸酶基因都申請了專利。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,最先分離出的植酸酶基因是Aspergillus ficuum NRRL 3135的phyA基因。該結(jié)構(gòu)基因全長1506bp，其中+46+147的102bp的核苷酸序列是一典型的真菌內(nèi)含子序列，其上有真菌內(nèi)含子的特征保守序列：Donor序列GTATGC、Lariat序列GCTGAC及Acceptor序列CAG。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,它的基因編碼467個氨基酸，根據(jù)信號肽序列結(jié)構(gòu)規(guī)則推斷，N端的19個氨基酸為信號肽，信號的肽切割位點在+19位的Gly之后。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,來源于Aspergillus ficuum

11、NRRL3135的植酸酶是一種糖基化蛋白，在phyA編碼的氨基酸序列上，發(fā)現(xiàn)了10個潛在的N一糖基化位點(AsnXSerThr，x為任意氯基酸)。從氨基酸推斷出的理論分子量約為51.4kD，糖基化后的表觀分子量在85 kD左右。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,氨基酸序列上存在組氨酸酸性磷酸酶的活性位點保守序列（Active-site sequence）：CQVTFAQVL_SRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+52+74，可歸為組氨酸酸性磷酸酶這一家族。Aspergillus ficuum NR-RL3135的phyA基因中G+C百分含量達到68.3，這是絲狀真菌中高表達蛋白編碼序

12、列所特有的特征之一。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,來源于絲狀真菌，尤其是曲霉的phyA基因無論在核苷酸來源、編碼的氨基酸序列等基因結(jié)構(gòu)上，還是在基因產(chǎn)物的酶學特征上均具有較高的相似性,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,例如他們的編碼基因長度相當，核苷酸同源性較高，編碼的氨基酸個數(shù)都在460480之間，氨基酸序列上也有較高同源性，均具有活性位點保守序列RHGxRxP，在氨基酸序列上有數(shù)量不等的潛在糖基化位點，翻譯后的蛋白都需要糖基化修飾后才具有正常的生物學活性。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,phyB基因與phyA相比，雖然也屬于組氨酸酸性磷酸酶家族，有活性位點保守序列RHGxRxP，但核苷酸序列

13、及編碼的氨基酸序列同源性較低，實際上它的最適底物不是植酸鹽，它僅是具有植酸酶活性的酸性磷酸酶。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,來源于細菌的植酸酶也是另一類植酸酶，它的編碼基因較短，編碼蛋白的分子量也小，它的核苷酸序列及編碼的核苷酸序列與phyA和phyB及已報道的磷酸酶基因沒有同源性，它也沒有普遍存在于phyA和phyB編碼蛋白上的活性位點保守序列RHGxRxP，這說明它不屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,對這一類植酸酶研究僅在近年來才開始涉及, 1998 年 Ker ovuo等才首次從 Bacillus s ubtilis 中分離出其完整的編碼基因。來源于 Bacil

14、lus s ubtilis 的植酸酶基因 phyC 全長 1152,編碼 383個氨基酸,其中 N 端的26 個氨基酸是信號肽序列。生物學活性依賴鈣離子的存在。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,目前唯一報道的植物來源的植酸酶基因是 Maugenset等 于 1998 年從萌發(fā)的玉米種子中分離的,成熟酶由兩個相同的亞基組成, 亞基的結(jié)構(gòu)基因( CDNA) 全長 1167bp, 編碼 387 個氨基酸, 理論分子量為 41kD。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,它與微生物來源的植酸酶沒有氨基酸序列同源性, 但存在一個包含活性位點保守序列 RHGxRxP 的 33 個氨基酸的同源區(qū), 與來源于 Aspe

15、rgillus f icuum NRRL3135 的 phyA 和 phyB 相比, 這一段氨基酸序列的同源性分別達到 48%和 51%。,植酸酶的分子生物學植酸酶基因,絲狀真菌來源的 p hyA 基因編碼的植酸酶,其 RHGxRxP 序列一般位于 N端,如 A sp er gillus f icuum NRRL3135 的 p hyA 中它的位置在+ 81 + 87, 而玉米植酸酶中, RHGxRxP 序列位置較靠后,在+ 204 + 210 的區(qū)域上。,植酸酶的分子生物學植酸酶的高級結(jié)構(gòu),對植酸酶的高級結(jié)構(gòu)研究較多的是來源于 Asp er gillusf icuum NRRL3135 的

16、phyA 編碼的植酸酶 PHYA, Kostrewa等利用 X 衍射分析了它的晶體結(jié)構(gòu)。,植酸酶的分子生物學植酸酶的高級結(jié)構(gòu),PHYA 的高級結(jié)構(gòu)中有 5 對二硫鍵: Cys8-Cys17、Cys48-Cys391、 Cys192-Cys442、Cys241-Cys295、 Cys413-Cys421, 用鹽酸胍變性處理后, 植酸酶活性喪失,說明二硫鍵在植酸酶的折疊上扮演著重要的作用。,植酸酶的分子生物學植酸酶的高級結(jié)構(gòu),PHYA 的晶體結(jié)構(gòu)可分為兩部分: 一個大的結(jié)構(gòu)域和一個較小的結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域的中心是一個由 6 片組成的折疊片。,植酸酶的分子生物學植酸酶的高級結(jié)構(gòu),PHYA 的晶體結(jié)構(gòu)在兩

17、個結(jié)構(gòu)域的內(nèi)表面有一很深的凹套, 凹套中有酶催化活性的必需氨基酸 Arg58 和 His59, 它們是植酸酶活性位點保守序列 RHGxRxP 中的前兩個氨基酸,在以前的研究中利用化學修飾的方法就已證實RHGxRxP 序列中的 Arg 58與鼠的低分子量酸性磷酸酶的晶體結(jié)構(gòu)有很高的結(jié)構(gòu)相似性, 說明它屬于組氨酸酸性磷酸酶家族 。,植酸酶的基因工程,植酸酶的基因工程主要是要解決兩個問題,一個是植酸酶在天然材料中表達水平太低,這造成植酸酶難以大量生產(chǎn)及生產(chǎn)成本過高的問題,通過基因工程技術利用生物反應器則有望成百上千倍地提高它的表達量。,植酸酶的基因工程,另一個問題是天然植酸酶的一些性質(zhì)不能完全適合飼

18、料加工業(yè)和飼料養(yǎng)殖業(yè)的要求,如抗逆性、 在動物體內(nèi)的有效性等,特別是植酸酶的熱穩(wěn)定性。,植酸酶的基因工程,利用基因工程的手段在分子水平上對基因進行遺傳操作,則有望使這些性質(zhì)得到改善。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,目前,植酸酶基因表達的研究主要集中在來源于曲霉的植酸酶基因 phyA 和 phyB 上。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,1993 年 Piddington 等將產(chǎn)植酸酶的 A . niger Var . A wamor i ALK0243 通過紫外誘變獲得植酸酶表達量較高的突變株 A.niger ALK02268,以它為受體, 將同樣來源于 A.nig

19、er Var . Awamori ALK0243 的植酸酶基因 phyA 和phyB 分別導入其中, 陽性克隆子中 phyA 的表達量達到 329u/ mL,比受體菌提高了 7.3 倍, phyB 的表達量提高了59倍。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,同年, Van Hartingsveldt 等將來源于 A . f icumm NRRL3135的 p hyA 基因?qū)Щ卦? 使 phyA 基因的拷貝數(shù)增加到 15 個以上, 從而使植酸酶的表達量提高到7600u/ mL。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,Moore E. 等在 A . oryzae 中表達來源于

20、酵母的植酸酶基因和來源于 A . niger762的 phyB 基因, 其結(jié)果也是使表達量分別提高到 840u/mL和 750u/ mL。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,從總體上看, 以上的這些表達研究獲得的表達水平還較低,但卻證實了利用基因工程手段來提高植酸酶的表達、 生產(chǎn)這一途徑的有效性。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,Van Gorcomd等將植酸酶基因 phyA 置于來源于 A .niger 的淀粉葡萄糖苷酶( AG) 啟動子之下, 信號肽序列用AG 信號肽的 18 個氨基酸序列等、 AG 信號肽的 24 個氨基酸序列及植酸酶原來的信號肽序列 3 種構(gòu)建

21、植酸酶基因重組到 A . niger 基因組中獲得陽性克隆子,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,在這 3 種構(gòu)建中其植酸酶在重組菌株中的表達量分別達到了 1.1, 0.5, 2.8x 105u/ mL, 與天然植酸酶產(chǎn)生菌株僅有不到 100u/ mL相比有了大幅度的提高, 目前,這一菌株已用來工業(yè)化生產(chǎn)植酸酶。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,1998 年我國采用異源受體畢赤酵母( Pichia pastoris )作為生物反應器高效表達了來源于 A . niger 963 的植酸酶基因phyA 。為了能在畢赤酵母中高水平表達,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶

22、基因,首先對其結(jié)構(gòu)基因進行了改造,去掉原 phyA 基因中的內(nèi)含子和信號肽編碼序列,在不改變所編碼氨基酸的情況下定點突變優(yōu)化了對此基因在酵母中高效表達起關鍵作用的 Arg 密碼子。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,改造后的植酸酶基因與來源于釀酒酵母的因子信號肽編碼序列3端以正確的閱讀框架融合, 啟動子采用誘型高效酒精氧化酶 1 啟動子,電擊轉(zhuǎn)化后將植酸酶基因整合到畢赤酵母基因組中,重組酵母中表達的植酸酶能分泌到培養(yǎng)基中,與天然植酸酶在酶學性質(zhì)上沒有差異， 具有正常的生物學活性。,植酸酶的基因工程在微生物中高效表達植酸酶基因,Arg 密碼子經(jīng)優(yōu)化改造后, 其植酸酶表達量比未經(jīng)優(yōu)化的

23、高約 37 倍。重組酵母經(jīng)高密度發(fā)酵后,植酸酶的表達量達到 5x105u/ mL 以上, 比原植酸酶產(chǎn)生菌 A . niger 963 的表達量高約 3000倍。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,植酸酶作用的底物 植酸磷是存在于植物性飼料中的,如玉米、 大豆等種子, 如果在它們種子中本身就含有足量的植酸酶,在飼喂過程中在動物的腸胃道中釋放出來降解飼料中植酸磷,這樣就省去了植酸酶添加劑的生產(chǎn)及在飼料中的添加,一舉兩得, 這無疑是植酸酶應用的最佳方法。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,90 年代科學家們開始嘗試這一方面的研究,并取得了階段性的進展。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程

24、,首先是從對模式植物煙草的研究開始的, Jan Pen 等將來源于 A . niger 的植酸酶基因phyA 轉(zhuǎn)移到植物煙草中,用35S 啟動子控制phyA,并用煙草的 PR-S 蛋白的信號肽序列取代phyA上原有的信號肽序列,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在煙草種子中檢測到了植酸酶活性,其表達積累量可達到種子中可溶性蛋白的 1%,表達的植酸酶能夠進行糖基化, 其分子量約為67kD, 脫糖基化處理后分子量降低到 60kD。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,煙草中表達的植酸酶的分子量比天然植酸酶 85kD 的分子量小, 其原因可能與植酸酶的糖基化上差異有關。動物飼喂試驗

25、表明, 其飼喂效果與在飼料中直接添加等量的植酸酶相當。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,另外, 儲藏在種子中的植酸酶有很好的穩(wěn)定性,在種子磨成粉的加工過程中及在室溫下儲存一年后植酸酶活性不喪失 。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,Verwoerd 等也做了類似的工作, 由于是利用非組織特異性啟動子組成型表達植酸酶, 所以在轉(zhuǎn)基因煙草中檢測到了植酸酶,其中在葉子中植酸酶的表達量最高,達到可溶性蛋白的14.4%。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,另外, 植酸酶在煙草中表達, 似乎并不影響煙草的形態(tài)、 生長、 及種子的萌發(fā)。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,Van Ooi j

26、en 等利用特異性cruciferin 啟動子在煙草種子中特異性表達植酸酶, 表達量達到種子中可溶性蛋白的 0.15%,而在轉(zhuǎn)基因莖、 根中未檢查到植酸酶的表達。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,以上僅是在模式植物煙草上進行的一些初步研究, 但卻證明了這一思路的可行性： 植酸酶基因可在植物中高表達,也可在種子中特異性表達 植酸酶基因的表達對植物生長、 形態(tài)及種子萌發(fā)沒有顯著影 在種子中的植酸酶具有很好的穩(wěn)定性。,植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程,這些結(jié)果為進一步將植酸酶基因轉(zhuǎn)化到真正的飼料作物玉米、 大豆中, 培養(yǎng)出種子富含植酸酶的大豆、 玉米提供了依據(jù)和可行性 。,植酸酶的基因工程植酸酶的熱穩(wěn)定性,目前,通過基因工程微生物發(fā)酵來大規(guī)模廉價生產(chǎn)飼料用植酸酶酶制