成骨、成脂誘導(dǎo)

1、間充質(zhì)干細胞成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基標準制作方法 瀏覽：185 | 更新：2013-07-01 11:12間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)細胞誘導(dǎo)分化時必然用到的就是培養(yǎng)液，配置出合適的培養(yǎng)液能夠促進細胞的分化，因此這一步操作時相當?shù)年P(guān)鍵。如何才能配置適合的誘導(dǎo)培養(yǎng)液呢？濟南中賽生物來介紹成骨與成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配備方法。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液配備與誘導(dǎo)操作：1.準備含10%fbs的-mem培養(yǎng)液；2.在備好的-mem培養(yǎng)液中添加50m 抗壞血酸, 10mm-磷酸甘油和100nm地塞米松；3.準備6孔培養(yǎng)板，將p4細胞按照5103個/平方厘米的規(guī)格接種于原始-mem培養(yǎng)液中；4.待細胞長至基本融合后，更換上述制備完成的成骨

2、誘導(dǎo)培養(yǎng)液；5.每三天換液一次，細胞長至7天時進行堿性磷酸酶染色；6.二十八天后再進行礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色。茜素紅染色方法介紹：1.去除細胞當前使用培養(yǎng)液，使用pbs清洗兩次；2.使用10%甲醛室溫固定15分鐘，完成后使用重蒸餾水沖洗兩次；3.按照1ml/孔加入40mm的茜素紅染色液，室溫孵育20min并輕微振蕩；4.清除掉沒有完全結(jié)合的染料，用重蒸餾水漂洗并振蕩5min重復(fù)4次；5.傾斜放置2min,吸取多余的重蒸餾水；倒置顯微鏡觀察拍照記錄。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液配備與誘導(dǎo)操作：1.配置fbs10%含量的hg-dmem培養(yǎng)液；2.在配制完成的hg-dmem培養(yǎng)液中加入1m地塞米松,10g/ml胰島

3、素，200m吲哚美辛和0.5mm ibmx；3.準備6孔培養(yǎng)板，將p4細胞按照2104個/平方厘米的規(guī)格接種于原始hg-dmem培養(yǎng)液中4.待細胞長至基本融合后，更換上述制備完成的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，在用只含有10g/ml胰島素的成脂維持培養(yǎng)液培養(yǎng)1天，如此交替循環(huán)培養(yǎng)至14天，使用紅油o染色。紅油o染色方法介紹：1.去除細胞使用的當前培養(yǎng)液，使用pbs清洗兩次；2.27.5%甲醛室溫固定20分鐘；3.重蒸餾水清洗3此，空氣中干燥；4.加入0.5%的紅油室溫孵育一小時；5.配制70%乙醇溶液清洗3次；6.倒置顯微鏡觀察拍照記錄。丁香園二、誘導(dǎo)成骨體系1試 劑溶 劑終 濃 度儲 存 濃 度1

4、ml體系加量dex去離子水0.1m1mm0.1lvcpbs50m50mm1l-磷酸甘油pbs10mm1m10l2dmem（hg）和10%fbs。33代以上細胞，24孔板每孔105個細胞，六孔板每孔6000個細胞，每三天半量換液，共誘導(dǎo)2周。成骨誘導(dǎo)劑：地塞米松（110-8mol/l），-甘油磷酸鈉10mmol/l、維生素c 50ng/ml，高糖dmem，青鏈霉素各100u/ml，體積分數(shù)10%的胎牛血清。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分：兔骨髓間質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基175 ml兔骨髓間質(zhì)干細胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 ml谷氨酰胺2 ml雙抗2 ml抗壞血酸400 l甘油磷酸鈉2 ml地塞米松20 l

5、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分：兔骨髓間質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基a液兔骨髓間質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基a175 ml兔骨髓間質(zhì)干細胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 ml谷氨酰胺2 ml雙抗2 ml胰島素400 libmx（ibmx, 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）200 l羅格列酮（吲哚美辛）200 l地塞米松200 l兔骨髓間質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基b液兔骨髓間質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基b175 ml兔骨髓間質(zhì)干細胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 ml雙抗2 ml谷氨酰胺2 ml胰島素400 l對成脂肪誘導(dǎo)要特別提醒你，用國產(chǎn)血清比進口的效果更好（仍為10%濃度）。我用的是sigma的地塞米松（d1756），25

6、mg包裝的，248元貴的驚人！須用無水乙醇溶解。我也用過病房常用的5mg的地塞米松磷酸鈉，效果也挺好的。首選的是dexamethasone-water soluble，cell culture tested。至少可以配成1:1000的母液，使用起來很方便。使用醫(yī)用制劑尤其要小心溶劑的問題，好些制劑不是融解在水里的，如果你沒有設(shè)置合適的陰性對照，會給你的實驗帶來bug。脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液：dmem,10fcs，10-6m地塞米松，100微克ml 1一甲基一3一異丁基一黃嘌呤，50微克ml抗壞血酸。很難找到一套抗兔的抗體。油紅染色的方法如下：脂肪油紅染色（原位）：1.稱取0.5g油紅干粉，溶于100ml異丙醇中，配成0.5油紅儲存液，棕色瓶保存。2.除去培養(yǎng)基用pbs洗滌1遍3.加10中性甲醛固定5min4.稀釋油紅儲存液，油紅;去離子水3:2，濾紙過濾，室溫放置10min（除去一些雜質(zhì)，染色結(jié)果更清晰）5.染色30min，如果是培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，加的體積覆蓋住板底即可。如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml。6. 顯微鏡觀察，及時照相，時間過長，脂肪滴會自發(fā)破裂，到時就前功盡棄了，幾個星期的努力歐！這位大蝦的油紅染色方法基本正確，但有幾個地方修改一下后效果會更好！第一，染色的時間減少到510