克隆技術(shù) (2).ppt

1、克隆技術(shù),組員：孫 旭 20090370117 王恩瑩 20090370118,克隆 技術(shù),克隆 技術(shù),克隆 技術(shù),“克隆”是“clone”的音譯,其含義是無性繁殖,即由同一個祖先細胞分裂繁殖而成的純細胞系,該細胞系中每個細胞的基因彼此是相同的。動物克隆,就是指通過無性繁殖由一個細胞產(chǎn)生一個和親代遺傳性狀一致、形態(tài)非常相像的動物。,克隆 技術(shù),從1938 年克隆設(shè)想的提出到現(xiàn)在克隆生物的出現(xiàn)，克隆技術(shù)已經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展。 早期的動物克隆研究僅限于兩棲類和魚類,直到20 世紀(jì)80 年代,核移植克隆技術(shù)才開始應(yīng)用于哺乳動物。根據(jù)供核細胞的不同,可將動物克隆研究分為三個階段:,克隆 技術(shù),胚胎細

2、胞克隆階段,1981 年, Illmensee 和Hoppe 報道了他們用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的內(nèi)細胞團細胞作為核供體,直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞質(zhì)中,重構(gòu)胚體外發(fā)育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宮,獲得克隆小鼠,這是第一次用胚胎細胞對哺乳類進行核移植獲得成功。,克隆 技術(shù),胚胎細胞克隆階段,1983 年,美國科學(xué)家利用核移植技術(shù)和細胞融合方法獲得了克隆小鼠。,1986 年,英國的Willadsen 用綿羊的8 16 細胞階段的胚胎細胞作為供體進行核移植,首次應(yīng)用電融合的方法克隆出一只小羊。,克隆 技術(shù),胚胎細胞克隆階段,此后,科學(xué)家們又相繼克隆出小鼠、綿羊、牛、兔、豬和猴等。,我國科

3、學(xué)家也在20 世紀(jì)90 年代成功開展了胚胎細胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和豬等研究。,克隆 技術(shù),同種體細胞克隆階段,1997 年2 月,英國羅斯林研究所Wilmut 等人宣布,他們用6 歲成年羊的高度分化的乳腺細胞進行了核移植,成功地獲得了克隆羊“多莉”,多莉,克隆 技術(shù),同種體細胞克隆階段,這是第一次用成年體細胞作為供核細胞,由此說明高度分化的成年動物的體細胞可在適當(dāng)條件下發(fā)生逆轉(zhuǎn),恢復(fù)全能性,這是生物技術(shù)史上具有劃時代意義的重大突破,是克隆技術(shù)的一個里程碑,也改寫了部分生物學(xué)的理論。,此后，克隆牛，克隆鼠，克隆豬等相繼出現(xiàn)，克隆技術(shù)進一步成熟。,克隆 技術(shù),異種體細胞克隆階段,異種體細胞克隆

4、與同種體細胞克隆的差異在于供核體細胞與受體卵母細胞來源于不同的物種。即將一種動物的體細胞核移植到另一種動物的去核(遺傳物質(zhì)) 卵母細胞中。,克隆 技術(shù),異種體細胞克隆階段,體細胞核能否在異種卵胞質(zhì)中去分化并支持早期發(fā)育,異種核質(zhì)能否相容,異種重構(gòu)胚能否著床并進行全程發(fā)育,?,遇到的問題,克隆 技術(shù),異種體細胞克隆階段,1999 年,中國科學(xué)院動物研究所生殖生物學(xué)國家重點實驗室將成年大熊貓體細胞作為供核體細胞移植到去核(遺傳物質(zhì)) 的日本大耳白兔卵母細胞中,成功地構(gòu)建出異種重構(gòu)胚,體外培養(yǎng)獲得孵化囊胚。,2001 年將重構(gòu)胚移植寄母子宮,獲得了著床的重大進展。,克隆 技術(shù),隨著體細胞克隆技術(shù)的發(fā)

5、展,它與人類生產(chǎn)和生活的關(guān)系也就愈發(fā)密切,不同研究領(lǐng)域的科研人員都認(rèn)識到克隆技術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用前景。,異種體細胞克隆階段,2001 年, Nature Biotechnolo2gy 上報道了異種體細胞克隆瀕危哺乳動物歐洲盤羊的成功,為瀕危動物的保護提供了重要的借鑒。,克隆 技術(shù),動物克隆技術(shù),產(chǎn)生克隆動物的方法稱為動物克隆技術(shù)。 通過顯微操作技術(shù)把細胞核(供體)移入去除遺傳物質(zhì)的成熟卵母細胞(受體)中，細胞核在移入的細胞質(zhì)的支持下，發(fā)生發(fā)育程序重編(reprogramming)，形成重組胚，使得核質(zhì)重組體與正常受精卵一樣，經(jīng)細胞分裂、分化，并在母體內(nèi)發(fā)育成一個新的動物個體口，這稱為細胞核移植

6、技術(shù)。在高等哺乳動物中，細胞核移植技術(shù)是生產(chǎn)克隆動物最為有效的克隆技術(shù)，因此，動物克隆技術(shù)實際上是指細胞核移植技術(shù)。,克隆 技術(shù),動植物 克隆,動物克隆技術(shù),目前，哺乳動物體細胞核移植技術(shù)形成了一套比較完善的程序，主要包括：核受體胞質(zhì)的準(zhǔn)備、核供體細胞的選擇和處理、重構(gòu)胚構(gòu)建、重構(gòu)胚激活以及重構(gòu)胚培養(yǎng)等。,克隆羊、克隆豬等都是動物克隆技術(shù)的成果。在后面的案例中詳細講述動物克隆技術(shù)。,克隆 技術(shù),動植物 克隆,植物克隆技術(shù),植物基因的克隆技術(shù)是生命科學(xué)研究的重要組成部分，是現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)中最核心的內(nèi)容，它是隨著20 世紀(jì)70 年代初DNA 體外重組技術(shù)的發(fā)明而發(fā)展起來的， 其目標(biāo)是識別和分離特

7、異基因并獲得基因完整序列，確定其在染色體上的位置，闡明其生化功能，并利用生物工程手段應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中去。,克隆 技術(shù),動植物 克隆,植物克隆技術(shù),功能克隆,功能克?。‵unctional Cloning）就是從蛋白質(zhì)的功能著手進行基因克隆， 是人類采用的第一個克隆基因的策略。,克隆 技術(shù),動植物 克隆,植物克隆技術(shù),功能克隆,根據(jù)已知的生化缺陷或特征確認(rèn)與該功能有關(guān)的蛋白質(zhì)， 分離純化蛋白并測定出部分氨基酸序列，根據(jù)遺傳密碼推測其可能的編碼序列，設(shè)計相應(yīng)的核苷酸探針， 雜交篩選cDNA 文庫或基因組文庫，或者使用該蛋白質(zhì)特異的抗體，篩選表達載體構(gòu)建cDNA 文庫， 通過抗原抗體反應(yīng)尋找特異的克

8、隆，最后對選中的克隆測序，獲得目的基因的序列。,克隆 技術(shù),動植物 克隆,植物克隆技術(shù),功能克隆,用這一策略克隆基因的關(guān)鍵在于必須首先分離出一個純的蛋白，測定出其一部分氨基酸序列或得到相應(yīng)抗體； 其次要構(gòu)建cDNA 文庫或基因組文庫； 然后要對文庫進行雜交篩選。,克隆 技術(shù),動植物 克隆,植物克隆技術(shù),定位克隆,定位克隆技術(shù)（positional cloning） 又叫圖位克隆（map-based cloning）， 是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法， 適合于克隆編碼產(chǎn)物未知的基因。,克隆 技術(shù),植物克隆技術(shù),定位克隆,其基本原理是:根據(jù)功能基因在基因組中存在相對較穩(wěn)定的基

9、因座， 在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進行精確定位的基礎(chǔ)上， 用與目標(biāo)基因兩側(cè)緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選含有大的插入片段的基因組文庫（如BAC 和YAC），用篩選到的陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群;,動植物 克隆,克隆 技術(shù),植物克隆技術(shù),再通過染色體步行（chromosomewalking） 逐步逼近候選區(qū)域或通過染色體登陸（chro-mosome landing）的方法獲得含有目標(biāo)基因的大片段克隆，將含有目標(biāo)基因的大片段克隆進行亞克隆，或以大片段克隆作探針篩選cDNA 文庫； 從而將目標(biāo)基因確定在一個較小的DNA 片段上并進行序列分析，通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補試驗分析，鑒定獲得目的基因。,定位克

10、隆,動植物 克隆,克隆 技術(shù),植物克隆技術(shù),植物中運用圖位克隆技術(shù)，從擬南芥、水稻、番茄、大麥、小麥、甜菜、馬鈴薯等植物中分離了幾十個重要的基因，并以抗病基因的克隆居多，如番茄的Mi 基因，Hero 基因；馬鈴薯的Gpa2 基因，擬南芥的RPW8 基因5、PBS1 基因、Rpp13 基因和水稻的Pita、Xa1、Pib等基因.,定位克隆,動植物 克隆,克隆 技術(shù),植物克隆技術(shù),定位克隆理論上適用于一切基因， 但由于定位克隆依賴于高密度的分子標(biāo)記連鎖圖譜， 因此該技術(shù)對于基因組較小， 重復(fù)序列少而且已經(jīng)構(gòu)建了高密度RFLP 或RAPD 等標(biāo)記圖譜的植物無疑是非常有效的，如擬南芥、水稻等模式植物。

11、,定位克隆,動植物 克隆,克隆 技術(shù),克隆效率太低，克隆動物早衰嚴(yán)重,克隆動物健康問題很多，世界各地的克隆動物流產(chǎn)、夭折、畸形現(xiàn)象都非常嚴(yán)重。,核移植總體效率低，一般僅為16。,克隆 技術(shù),存在的問題,克隆效率太低，克隆動物早衰嚴(yán)重,這可能與供體核移入受體胞質(zhì)后的重塑有關(guān)。供體核發(fā)生去甲基化、去乙?；榷喾N變化引，在核重塑過程中基因表達異常都可能導(dǎo)致克隆效率降低口引。這說明應(yīng)進一步明確供核基因組的甲基化和乙?；c核移植胚胎發(fā)育的作用機制。,克隆 技術(shù),存在的問題,克隆效率太低，克隆動物早衰嚴(yán)重,克隆動物效率低與核移植胚胎細胞內(nèi)的染色體異常、胚胎細胞凋亡、胚胎早期死亡、流產(chǎn)、胎盤發(fā)育異?？诨糜嘘P(guān)

12、。重組胚胎的形態(tài)、發(fā)育潛能與胚胎細胞凋亡，囊胚的內(nèi)細胞團之間，內(nèi)細胞團同滋養(yǎng)層細胞之間的關(guān)系與細胞數(shù)量的比例之間關(guān)系及發(fā)育機制需進一步深入研究。染色體異常與核移植胚胎的妊娠失敗和克隆動物的先天性畸形之間的關(guān)系尚不清楚。,克隆 技術(shù),端粒問題,存在的問題,在正常生理條件下的體細胞隨著分裂次數(shù)的增加，端粒會逐漸縮短。,克隆羊“多莉”細胞端粒較短，可能影響其壽命。,克隆 技術(shù),存在的問題,Shiels等報道克隆羊端粒較同年羊的短。,端粒問題,Tian等報道以牛胎兒成纖維細胞作供體的核移植后代端粒比對照組長。,Miyashita等報道克隆個體間端粒長度差異顯著。,克隆 技術(shù),存在的問題,端粒問題,這一

13、系列的研究結(jié)果表明，克隆后代端粒長度有差別。 端粒長度可能不是造成克隆動物高死亡率的原因。在胚胎發(fā)育過程中的端粒機制還有待進一步深入研究。,克隆 技術(shù),存在的問題,重新編程的問題,重新編程的機制不明，缺乏基礎(chǔ)理論支撐。,有些學(xué)者認(rèn)為卵母細胞內(nèi)有重編程因子存在，也有學(xué)者認(rèn)為，和有絲分裂原激活蛋白激酶的活性與重編程沒有直接調(diào)控關(guān)系。,克隆 技術(shù),存在的問題,重新編程的問題,最近的研究表明，重編程可能在核移植后的早期就已經(jīng)啟動，隨著胚胎發(fā)育逐步深入會造成發(fā)育阻斷或抑制，對不同階段胚胎發(fā)育所需的最佳環(huán)境培養(yǎng)的深入研究有助于闡明重編程機制。,克隆 技術(shù),存在的問題,因印跡機理不清,基因印跡(imprin

14、ting)是同源染色體上基因表達活性不同的遺傳現(xiàn)象?；蛴≯E現(xiàn)象在哺乳動物的發(fā)育過程中普遍存在，它與胚胎的生長發(fā)育和胎盤功能等都有關(guān)系。,克隆 技術(shù),存在的問題,因印跡機理不清,合子前不完全重新編程影響著印跡基因和大多數(shù)非印跡基因的表達，從而導(dǎo)致克隆動物異常?；蛴≯E對核移植后基因組重新編程的影響不明確。基因印跡與動物克隆技術(shù)的成功及關(guān)系值得深入研究。,克隆 技術(shù),存在的問題,克隆技術(shù)條件有待完善,動物克隆研究已在理論基礎(chǔ)、技術(shù)優(yōu)化及實際應(yīng)用等方面取得很大進展，但該技術(shù)目前還很不完善，克隆機理性的相關(guān)理論研究還很薄弱。,另外，克隆胚胎與正常胚胎發(fā)育有何異同；胚胎細胞超顯微結(jié)構(gòu)及其功能等；線粒體

15、與核移植胚胎發(fā)育的關(guān)系；細胞核移植的克隆動物在發(fā)育生物學(xué)中的一些基礎(chǔ)問題有待解決。,克隆 技術(shù),克隆技術(shù)條件有待完善,存在的問題,對以上問題的深入研究，將有助于加深人們對動物胚胎發(fā)育過程中分子機制的認(rèn)識。動物克隆技術(shù)的不斷完善，還需要分子遺傳學(xué)、細胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的進一步研究和發(fā)展。因此，要提高動物克隆的成功率尚需不懈的努力。,克隆 技術(shù),胚胎干細胞核移植克隆技術(shù),兔卵母細胞的準(zhǔn)備,超排處理的母兔在注射絨毛膜促性腺激素(HCG) 后15 17 h 內(nèi)擇頸處死, 從輸卵管內(nèi)沖出卵母細胞。將收集到的卵母細胞置于含0. 2% 透明質(zhì)酸酶的磷酸緩沖液( PBS) 中, 用與卵子直徑相當(dāng)?shù)?/p>

16、pippe 玻璃管, 吹吸除去卵丘細胞, 置于FCS-199A TCM199 + 5. 0 mmol/ L Hepes + 5. 0mmol/ L NaHCO3+ 3% 發(fā)情牛血清( OCS) + 抗生素 溶液中備用。,克隆 技術(shù),胚胎干細胞核移植克隆技術(shù),固定針、吸核針、切割去核針的制備,克隆 案例,分別在拉針儀上及鍛針儀上, 制備了不同類型的微玻璃針若干。 主要技術(shù)參數(shù): 持卵針口徑100 Lm( 與卵徑相當(dāng)) , 去核針前段長度10 Lm, 注核針口徑20 30 Lm, 30 40b的斜口。,克隆 技術(shù),胚胎干細胞核移植克隆技術(shù),克隆 案例,卵子去核,選擇裸化卵子中含第一極體細胞質(zhì)均勻的

17、卵子移入FCS-199 TCM199 + 5. 0mmol/ L Hepes+ 5. 0 mmol/ L NaHCO3+ 3% OCS+7. 5 Lg/ mL 細胞松弛素B( CB) 去核操作液, 用顯微操作儀的固定針調(diào)整卵子極體指向12 時方向, 去核針則在1 時方向刺入透明帶并貫穿對側(cè)( 11 時方向) , 移動操作臂切開極體上部透明帶,抽出切割針, 將針調(diào)整到卵子2 時方向處壓迫擠出第一極體及下部約30%的核質(zhì)。,克隆 技術(shù),胚胎干細胞核移植克隆技術(shù),克隆 案例,卵子去核,去除核質(zhì)的部分用Hoechst33342 染色熒光加以鑒別。去核空卵則移入FCS-199A 溶液中待用。,去核操作,

18、核質(zhì)確認(rèn),克隆 技術(shù),胚胎干細胞核移植克隆技術(shù),克隆 案例,預(yù)處理,選取傳代培養(yǎng)2 8 代的獺兔ESC 集落, 經(jīng)0. 05%胰酶+ 0. 04% EDTA 消化2 5 min 后, 重懸于培養(yǎng)基中, 接種在35 mm 組織培養(yǎng)皿中30min, 除去飼養(yǎng)細胞和細胞碎片用于核移植。,克隆 技術(shù),胚胎干細胞核移植克隆技術(shù),克隆 案例,ESC 核轉(zhuǎn)入操作液,在含0. 1%牛血清蛋白( BSA) 的操作液TCM199 中添加0. 1%聚乙烯醇( PVA) , 利用顯微操作儀的注核管逐個吸取ESC 細胞核注入去核完全受體卵母細胞的卵周隙, 之后將含ESC 核復(fù)合卵子移入融合液( 10% FCS 的TCM199) 小滴, 石蠟油覆蓋, 平衡10 min 后進行電融合。,克隆 技術(shù),胚胎干細胞核移植克隆技術(shù),克隆 案例,轉(zhuǎn)入胚電融合,電融合時, 將注核卵母細胞移到電極間的融