轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過加減特定的DNA片段而改變了基因構(gòu)成和性狀的動(dòng)物，也可以認(rèn)為是指體內(nèi)基因組中穩(wěn)定地整合有外源基因的動(dòng)物。該項(xiàng)技術(shù)始于80年代初，很快便成為研究動(dòng)物基因表達(dá)特性及其功能的重要手段，在基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制等方面的基礎(chǔ)理論研究、家畜家禽的遺傳性狀改造、培育能為人類提供器官移植材料的家畜、培育人類疾病的模型動(dòng)物、作為生物反應(yīng)器主產(chǎn)工業(yè)和醫(yī)學(xué)所需要的珍貴生物活性蛋白等方面被廣泛應(yīng)用。本文主要對其在人類醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景作以論述。1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備技術(shù)用以培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)叫做轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因轉(zhuǎn)移。其總體過程是：首先從某種動(dòng)物分離目的基因或人工構(gòu)建該

2、目的基因，把該目的基因在體外進(jìn)行重組和擴(kuò)增，然后再把加工好的目的基因設(shè)法導(dǎo)入另一個(gè)同種或異種動(dòng)物受精卵的原核內(nèi)(或細(xì)胞質(zhì)內(nèi))，使其穩(wěn)定地整合到受體細(xì)胞的基因組中，最后使該受精卵發(fā)育成攜帶外源目的基因的個(gè)體，即產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前常用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有：1)原核內(nèi)顯微注射法 是將在體外構(gòu)建的目的基因，在顯微操作儀下用極細(xì)的微吸管注射到處于原核時(shí)期的受精卵的原核中，讓這種外源基因通過某種方式整合到受體細(xì)胞的基因組中去，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的目的。2)轉(zhuǎn)染技術(shù) 主要以RNA病毒或DNA病毒為載體，在體外將目的基因或連同啟動(dòng)子等序列一同重組到病毒的核酸載體上。再讓該病毒感染受精卵或胚胎于細(xì)胞，利用載體病毒具

3、有主動(dòng)整合到受體細(xì)胞基因組中去的特性，讓其連同所攜帶的目的基因等也一同整合到受體細(xì)胞的基因組上去。90年代后又出現(xiàn)了兩種較新的方法，即基因剔除和基因楔入技術(shù)。3)細(xì)胞載體技術(shù) 主要使用胚胎干細(xì)胞(ES)作為操作對象。胚胎干細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離得到的一種二倍體細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)并保持全能分化的潛能，一旦回復(fù)到適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下即可形成胚系集落?？梢杂棉D(zhuǎn)基因技術(shù)將外源目的基因轉(zhuǎn)移到胚胎干細(xì)胞中，通過同源重組或轉(zhuǎn)換的方法使外源基因整合到胚胎干細(xì)胞的基因組中。而且，還可以根據(jù)由于外源基因的插入所產(chǎn)生的基因表達(dá)方面的改變，來對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)篩選，從而大大提高轉(zhuǎn)基因的成功率。被轉(zhuǎn)基因后

4、的胚胎干細(xì)胞經(jīng)鑒定后可被移植到正常發(fā)育的囊胚中，再將囊胚導(dǎo)入假孕的代理母親子宮內(nèi)發(fā)育而產(chǎn)生出嵌合體動(dòng)物，然后與正常的雄性動(dòng)物交配即可獲得生殖系攜帶外源基因的純合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前還有用快速分裂的哺乳動(dòng)物乳腺肌上皮細(xì)胞或小鼠精子作為細(xì)胞載體。2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用21 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生物制藥方面的應(yīng)用 生物制藥的主要目標(biāo)是比較經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)能夠從容易獲取的流體(如培養(yǎng)發(fā)酵液、乳汁、尿或血液)中提取的貴重人用(或獸用)治療蛋白。而用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行生物制藥，盡管可以從動(dòng)物的尿或血液中獲取藥用蛋白，但是，目前來看，最好的途徑是從大動(dòng)物的乳汁中來獲取。不但乳汁的產(chǎn)量特別高，而且乳汁中的蛋白含量也高(依動(dòng)物

5、不同約在3060g/L)，乳汁不進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，其中所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)不會(huì)影響到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本身的生理代謝過程；另外，從乳汁中提純蛋白相對要比從其他液體中提純更為容易，而且在乳汁中所表達(dá)的蛋白已經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。甚至有時(shí)還可直接應(yīng)用乳汁作為治療所需的終產(chǎn)品。因此，人們將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺稱為生物反應(yīng)器。從乳汁生產(chǎn)來考慮，首選動(dòng)物一般是牛、山羊、綿羊、豬和家兔。上述生物制藥工藝的第一步就是構(gòu)建能在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺定位表達(dá)所需蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建物。此構(gòu)建物通常含有為目的蛋白編碼的序列和一個(gè)乳汁蛋白特異性啟動(dòng)子。有時(shí)還要在構(gòu)建物上加上另外的調(diào)節(jié)因子，以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的高效表達(dá)或者不受整合位

6、置影響地表達(dá)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有一種特異性蛋白啟動(dòng)子山羊-酪蛋白啟動(dòng)子可以啟動(dòng)若干種以cDNA為基礎(chǔ)的構(gòu)建物的高水平表達(dá)而不需要其他調(diào)節(jié)因子。有了這樣的啟動(dòng)子，則直接連接上結(jié)構(gòu)基因就可以了，不再需要另外的調(diào)節(jié)因子。工藝的第二步是把基因構(gòu)建物導(dǎo)入所選擇動(dòng)物的受精卵中，然后使其在代養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育出生(當(dāng)然有時(shí)也可通過細(xì)胞載體方法生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物嵌合體)。在仔動(dòng)物出生后，檢測其基因組中是否組合有轉(zhuǎn)入的外源目的基因。牛、羊的后代整合率可達(dá)510。一旦鑒定轉(zhuǎn)基因成功，此動(dòng)物就被稱為“祖先”動(dòng)物，應(yīng)細(xì)心把它飼養(yǎng)至性成熟，并把雌性祖先動(dòng)物配種使其產(chǎn)乳。同時(shí)，用所獲得的雄性祖先動(dòng)物與其他動(dòng)物雜交，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雌

7、性后代并檢測其乳汁中是否有轉(zhuǎn)基因蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)基因在乳用動(dòng)物中表達(dá)的最高值一般都類似或高于在預(yù)試驗(yàn)小鼠乳汁中的表達(dá)值。在某些物種，現(xiàn)已有辦法來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因于性成熟前或性成熟后馬上在乳汁中表達(dá)。這樣就可以使樣品的檢驗(yàn)及下游的提純方法的研制提前進(jìn)行。自乳汁中提純治療蛋白的基本原理與從細(xì)胞培養(yǎng)液中提純重組產(chǎn)品一樣。首先要除去乳中的酪蛋白分子團(tuán)(假如酪蛋白不是所需蛋白)和脂肪球；然后，經(jīng)過常規(guī)層析方法分離出適合人用的高純度(99.9)蛋白質(zhì)。由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中提取的蛋白質(zhì)的藥物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)與其他基因工程蛋白的一樣，必須向有關(guān)部門提供諸如特性、純度、穩(wěn)定性和安全性等關(guān)鍵指標(biāo)。目前，已從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)出的治

8、療蛋白主要有：在奶山羊乳汁中高效表達(dá)的抗凝血酶III和-1-蛋白酶抑制因子，在綿羊乳汁中表達(dá)的-1-抗胰蛋白酶、人凝血因子IX，在牛乳中表達(dá)的-乳白蛋白、乳鐵蛋白，在兔乳汁中表達(dá)的-葡萄糖苷酶等。這些蛋白在醫(yī)療上都有重要作用，如-1-抗胰蛋白酶可以治療北美洲常見的肺氣腫病，凝血因子IX是治療血友病的珍貴藥物。除了從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中可得到上述珍貴藥物外，目前還從轉(zhuǎn)基因小鼠或豬的血液中得到人類血紅蛋白、人免疫球蛋白重鏈等貴重產(chǎn)品。22 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在人類遺傳病分析治療中的應(yīng)用 部分醫(yī)學(xué)工作者認(rèn)為，幾乎所有人類疾病(除外傷之外)都有一定的遺傳因素參與，在一定程度上都可看作是遺傳病。這提示我們研究人類

9、遺傳與疾病的關(guān)系是非常重要的。而我們的近代遺傳學(xué)知識(shí)幾乎都是從微生物或低等動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中得來的，而從人類遺傳病中得來的知識(shí)是相當(dāng)少的。利用轉(zhuǎn)基因制造出各種遺傳病的動(dòng)物模型，則給研究人類遺傳疾病帶來了極大的方便。由于小鼠與人類基因的同源性很高，故小鼠的許多遺傳病模型與人類相應(yīng)的疾病具有可比性。而且現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)用的小鼠都有明確的遺傳背景、又易于飼養(yǎng)與繁殖，人們對小鼠有著成熟的遺傳操作技術(shù)，因而使轉(zhuǎn)基因小鼠被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論的研究。目前，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成功地制備了與人類多種遺傳病相應(yīng)的遺傳性改變了的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。人們可以通過基因剔除技術(shù)完全排除其他基因的影響，以檢測一個(gè)確定的遺傳改變所產(chǎn)生的效應(yīng)

10、，以確定致病基因的功能和致病機(jī)理，闡明其結(jié)構(gòu)及其在染色體上的定位，并探究基因型與環(huán)境因素的關(guān)系。另外，用小鼠cDNA為探針，還可以克隆得到相應(yīng)的人類基因，這是一種簡便而快捷的克隆人類致病基因的方法，將使人類能夠深入洞察遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)理，弄清人類基因組調(diào)節(jié)控制人體各種遺傳性狀的規(guī)律，從而進(jìn)行科學(xué)的診治。目前，在培育人類遺傳疾病模型動(dòng)物方面已經(jīng)培育出了動(dòng)脈粥樣硬化、鐮刀形紅細(xì)胞貧血、初老期癡呆癥、自身免疫病、淋巴組織生成、真皮炎及前列腺癌小鼠等多種疾病的模型動(dòng)物。23 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)可供人類移植用的器官 在人用器官供體培育方面，最早是用小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在已經(jīng)生產(chǎn)出了可為人類提供器官的轉(zhuǎn)基因

11、豬。目前轉(zhuǎn)基因豬的肝臟可用于虛弱的無法接受肝臟移植手術(shù)的急性病人進(jìn)行離體灌注。這些豬經(jīng)過遺傳工程改造，可表達(dá)能封閉補(bǔ)體介導(dǎo)的高敏排斥反應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而減少排異反應(yīng)。目前，這樣的器官還只能是短期代用，不能永久移植。從長遠(yuǎn)看，還必須研究出可永久性移植的器官來。3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在人類醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景展望轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究和應(yīng)用是最近十幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)。其在人類醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用還僅僅是在試驗(yàn)性的初期階段，與其說它給人類醫(yī)學(xué)帶來了什么實(shí)際效益，倒不如說它給人類醫(yī)學(xué)帶來了更多的希望和廣闊的應(yīng)用前景。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器方面，雖然已經(jīng)生產(chǎn)出了十余種珍貴產(chǎn)品，但由于技術(shù)上的不成熟，目前在產(chǎn)品成本上還沒有顯示出多大的優(yōu)越性。隨著技術(shù)上的不斷成熟，這種現(xiàn)象將會(huì)大大改觀。據(jù)國外經(jīng)濟(jì)學(xué)家推算，若用其他生產(chǎn)工藝(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞株培育技術(shù))來生產(chǎn)1g藥物蛋白，成本需要8005000美元，而利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物則只需要0.020.5美元。從實(shí)用性上來說，就目前的認(rèn)識(shí)水平而言，還找不到其他任何一種生物(除人類本身外)能夠象轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺那樣生產(chǎn)出與人類蛋白最接近的，經(jīng)過修飾加工的，對人類來說具有高水平生物活性而又相對比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。盡管經(jīng)過了幾千年的文明史，人類的科學(xué)技術(shù)有了極大的提高，而維持我們生命所需要的食物還仍然是依靠最