免疫標(biāo)記技術(shù)

1、免疫標(biāo)記技術(shù),Immunolabeling technique,第一節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念,一、免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫的概念 二、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì),免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫,免疫標(biāo)記技術(shù)： 標(biāo)記物與免疫活性物質(zhì)的聯(lián)接技術(shù) 標(biāo)記免疫技術(shù)： 以標(biāo)記免疫物質(zhì)檢測相應(yīng)靶物質(zhì)的技術(shù),免疫標(biāo)記技術(shù) =,免疫技術(shù)+ 標(biāo)記技術(shù),酶,熒光素,同位素,其它,常用的免疫標(biāo)記物質(zhì),類別 標(biāo)記物 用途 熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定 化學(xué)發(fā)光物 Lumin

2、ol、lucigenin 免疫分析測定 金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定,第二節(jié) 標(biāo)記免疫技術(shù)的分類,一、按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型 二、按測定方式劃分的類型 三、按測定用途劃分的類型,1、酶免疫技術(shù) 2、熒光免疫技術(shù) 3、放射免疫技術(shù) 4、金免疫技術(shù),按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型,1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）,按測定方式劃分的類型,均相型（homogenous）,非均相型（heterogeneous）,1、免疫測定技術(shù) 2、免疫組化技術(shù),按測定用途劃分的類型,第三節(jié) 酶標(biāo)記技術(shù),一、常用標(biāo)記方法 二、標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,常用標(biāo)記

3、方法,1、常用酶 辣根過氧化物酶（HRP） 堿性磷酸酶（AP） 2、標(biāo)記方法 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法,戊二醛交聯(lián)法 (一步法）,抗體-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗體,酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,戊二醛交聯(lián)法（二步法）,COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗體-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,過碘酸鹽氧化法,NaIO4,O,O,O

4、H,+ NH2抗體,O,O,O,N,N,抗體,抗體,H2O,N,抗體,NaBH4,Schiff堿,酶-五炭糖環(huán),標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析 2、鑒定 抗體活性 酶活性 標(biāo)記物純度,酶聯(lián)免疫吸附實驗 enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA ）,ELISA基本的實驗過程,ELISA技術(shù)的原理與方法,間接法 夾心法 競爭法,間接法,夾心法,競爭法,第四節(jié) 熒光標(biāo)記技術(shù),一、常用標(biāo)記方法 二、標(biāo)記免疫物的分離與純化,常用標(biāo)記方法,1、熒光素的概念 2、生物標(biāo)記熒光素的要求 3、常用熒光素標(biāo)記原理與方法,生物標(biāo)記熒光

5、素的要求,1、具有與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的能力 2、熒光效率高 3、能與背景物質(zhì)形成鮮明對比 4、不影響蛋白質(zhì)的生物、免疫活性 5、標(biāo)記方法安全、簡便 6、標(biāo)記物穩(wěn)定，易保存,熒光抗體技術(shù)的原理與方法,直接法 間接法 補(bǔ)體法 雙標(biāo)記法,直接法,間接法,補(bǔ)體法,雙標(biāo)記法,標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,1、分離 目的：去除游離熒光素 方法：柱層析 2、鑒定 抗體活性 標(biāo)記物結(jié)合度 F/P比值的應(yīng)用意義,第五節(jié) 放射性核素標(biāo)記技術(shù),一、常用標(biāo)記方法 二、標(biāo)記免疫物的分離與純化,直接法（氯胺T法）,Na125I 4。C,125I,氯胺T,間接法（連接法）,+ Na125I,氯胺T,125I,NSHPP,結(jié)合相,游

6、離相,放射免疫分析法的原理與方法,常用標(biāo)記方法,1、常用放射性核素 2、125I 的標(biāo)記方法 直接法（氯胺T法） 間接法（連接法）,標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,1、分離 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析 2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）應(yīng)用意義,第六節(jié) 膠體金標(biāo)記免疫技術(shù) (金標(biāo)法),膠體金是由氯化金與還原劑反應(yīng)形成的一種膠體顆粒，具有吸附蛋白質(zhì)的特性(可以標(biāo)記Ag或Ab)； 膠體金顆粒具有呈色性，中等大小的膠體金顆粒呈現(xiàn)酒紅色。 膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)是將金顆粒光學(xué)檢測的靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。,膠體金免疫法與RIA、ELISA等方法相比,有許多優(yōu)點：,1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和顯色劑，使操作更簡便;,2.膠體金法無污染，不含危害操作者即污染環(huán)境;,3.膠體金標(biāo)抗體在凍干狀態(tài)