實驗二：葉綠體的分離與熒光觀察.ppt

1、實驗二,葉綠體的分離與熒光觀察,細胞生物學實驗,實驗目的,1.通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法。 2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。,實驗原理,細胞器分離的過程包括兩個主要階段：破碎細胞和細胞組分的分離 在等滲溶液中進行組織勻漿、分離 葉綠體的分離采用差速離心或密度梯度離心法進行 利用熒光顯微鏡觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光（次生/誘發(fā)熒光）,常用的細胞破碎方法,離心分離技術(shù),離心是分離細胞組分和生物大分子最常用的分離方法，因為不同的細胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力不同介質(zhì)沉降分離。 分離各種細胞組分的方法主要有： 差速離心

2、密度梯度離心 速率-區(qū)帶梯度離心 等密度離心,差速離心,主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。 差速離心的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取,密度梯度離心,用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞器分層、分離的方法。這類分離又可分為速率-區(qū)帶梯度離心和等密度梯度離心兩種。 優(yōu)點是一

3、次離心可分離提純樣品中幾種組份，用于較精細的分離。,速率-區(qū)帶梯度離心和等密度梯度離心,原理：根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，通過離心力場的作用，使不同的顆粒在密度梯度層內(nèi)形成一系列區(qū)帶，從而達到彼此分離的方法。,A、速率-區(qū)帶梯度離心流程圖,B、等密度梯度離心流程圖,原理：根據(jù)不同顆粒在密度梯度介質(zhì)中存在著浮力密度差，在離心力場作用下，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置上形成區(qū)帶，從而使不同浮力密度的顆粒得到分離的方法。,兩種密度梯度離心方法的異同,表1:各種亞細胞構(gòu)造在不同的離心介質(zhì)中分離所需的離心力與時間,各種細胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉

4、降系數(shù),圖:各種細胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉降系數(shù),根據(jù)1924年Svedberg（離心法創(chuàng)始人-瑞典蛋白質(zhì)化學家）對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。以每單位重力的沉降時間表示，并且通常為120010-13秒范圍，10-13這個 因子叫做沉降單位S,即1S=10-13秒,看圖思考：要將細胞勻漿液中的得到更純的分離，選用哪種離心方法較好？(線粒體:1.18g/ml、溶酶體:1.12g/ml、微體:1.23g/ml),離心力與離心機轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)換公式：,圖2:離心力與離心機轉(zhuǎn)數(shù)的轉(zhuǎn)換列線圖,RCF1.11810-5r(n) (g),式中,RCF表示相對離心力,單位是重力加速

5、度g（980厘米/秒2）, (g)表示重力加速度的倍數(shù),r 為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，指離心管的重心至轉(zhuǎn)軸中心間的距離，單位為厘米；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。,為了便于進行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，人們在此公式的基礎(chǔ)上制作了離心力的列線圖。見圖2. 先在離心機半徑標尺上取已知的離心半徑和在轉(zhuǎn)速標尺上取已知的轉(zhuǎn)速，然后在這兩點間取一條直線，與中間RCF標尺上的交叉點，即為相應(yīng)的相對離心力數(shù)值，也是 文獻中常用的g。,r=8cm n=15,000rpm,RCF20,000g,熒光,熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象： 某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能

6、在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。若停止供能，熒光現(xiàn)象立即停止。 有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光,稱為自發(fā)熒光。如葉綠素的火紅色熒光。 有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，稱為間接熒光。如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光。,1.兩組光源:透射照明光源(鹵素燈)；熒光光源(超高壓直流汞燈或氙燈)； 2.有特殊的濾光片:激發(fā)濾色片和阻斷濾片 3.激發(fā)光波長：較短，因此，分辨力高于普通顯微鏡； 4.熒光光源照明方式：通常為落射式。,紫外光(UV)：激發(fā)光譜區(qū)域：330-400nm; 紫光(V)：激發(fā)光譜區(qū)域：395-4

7、15nm; 藍光(B)：激發(fā)光譜區(qū)域：420-485nm; 綠光(G)：激發(fā)光譜區(qū)域：460-550nm ；,熒光顯微鏡的 特點：,圖：落射式熒光顯微鏡的光路,熒光染料:吖啶橙(acridine orange ),吖啶橙是一種與DNA和RNA都能結(jié)合的熒光染料 在紫外光或藍光(330485nm)激發(fā)下，DNA可被激發(fā)出530nm的熒光發(fā)射峰(細胞核發(fā)亮綠色熒光)，RNA可被激發(fā)出640nm的熒光發(fā)射峰(核仁和胞質(zhì)RNA發(fā)桔紅色熒光)。 產(chǎn)生兩種不同熒光是由于吖啶橙與雙鏈DNA 和單鏈DNA或RNA的結(jié)合方式和結(jié)合量不同而決定的。DNA是高度聚合物，它與DNA結(jié)合是潛入雙鏈之間，結(jié)合量相對少；而

8、與單鏈DNA或RNA的結(jié)合則由靜電吸引堆積在磷酸根上，結(jié)合量相對多些。 我們推測，葉綠體的次生熒光的來由，大部分來自葉綠體的吸附作用，極少部分來自葉綠體中的RNA.,加入吖啶橙后葉綠體的自發(fā)熒光（火紅色）消失了？ 原因：是熒光淬滅現(xiàn)象所致。吖啶橙是一種芳香雜環(huán)陽離子型染料，可透過細胞膜，因此而推測吖啶橙陽離子是進入葉綠體膜內(nèi)通過影響葉綠素分子的結(jié)構(gòu)或所處的化學環(huán)境使自發(fā)熒光淬滅的。,熒光淬滅：在產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的溶液中加入鹽等物質(zhì)會使溶液的吸光度下降而熒光強度變小的現(xiàn)象。 熒光淬滅現(xiàn)象產(chǎn)生原因：分子結(jié)構(gòu)和化學環(huán)境是影響物質(zhì)發(fā)射熒光和熒光強度的重要因素（pH、溫度、光、淬滅劑）.,實驗用品,材料：

9、 菠菜葉片 試劑：蒸餾水，0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(AO) 儀器：普通離心機，組織搗碎機，天平，熒光顯微鏡，顯微鏡，鑷子，培養(yǎng)皿，紙，移液管，滴管，燒杯，無熒光載片，蓋玻片，離心管,吸水紙等,配制方法：稱取0.1g吖啶橙加蒸餾水100ml做干液，放冰箱備用，臨用前取1ml干液加1/15mol/L磷酸緩沖液（pH4.8）9ml。,菠菜葉片(去葉脈)3g 0.35mol/L氯化鈉15ml研磨(冰浴)勻漿過濾(2層尼龍網(wǎng))濾液在1000rpm離心2min棄沉淀，上清液3000rpm離心5min 去上清液沉淀為葉綠體(混有部分細胞核)，用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮 滴片觀察

10、 取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用分別用普通光學顯微鏡觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和熒光顯微鏡觀察自發(fā)熒光 將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料，蓋上無熒光的蓋玻片,使用熒光顯微鏡觀察間接熒光 取葉表皮臨時裝片熒光染色觀察,實驗步驟,實驗結(jié)果,普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色顆粒，即基粒。 熒光顯微鏡下，選用藍色激發(fā)濾光片，葉綠體自發(fā)熒光為火紅色，間接熒光為桔紅色。細胞核呈黃綠色。,圖：葉綠體自發(fā)熒光為火紅色,葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉)中進行,以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。 分離過程最好在05的條件下進行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。 離心機使用：離心管要平衡 熒光顯微鏡使用 熒光顯微鏡檢要在光線盡量暗的環(huán)境下進行 使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛 凡是熒光染料都有一定毒性，請做好防護 利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物質(zhì)進行檢測時，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等 在熒光觀察時應(yīng)抓緊時間,有必要時立即拍照。 在制作熒光顯微標本時最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油。 汞燈開啟后15min內(nèi)不要關(guān)閉,注