多重PCR技術(shù)課件

1、多重PCR技術(shù),多重PCR技術(shù),多重PCR技術(shù),講解框架,第一、多重PCR技術(shù)原理 第二、多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計：大致的如何操作 1、 多重PCR擴(kuò)增區(qū)域的選擇 2、 引物的設(shè)計（關(guān)鍵步驟） 3、多重PCR反應(yīng)條件的確定 第三、多重PCR條件優(yōu)化 1、反應(yīng)體系優(yōu)化 2、引物設(shè)計 3、模板核酸質(zhì)量 4、循環(huán)參數(shù)優(yōu)化 第四、多重PCR技術(shù)結(jié)果分析 第五、多重PCR技術(shù)在食品中的應(yīng)用,多重PCR技術(shù),一、多重PCR技術(shù)原理,PCR是什么：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。 其基本原理是：以一對寡核苷酸為引物，在模板DNA、dNTP(脫氧核苷三磷酸) 、適當(dāng)緩沖液Mg

2、2+的混合體系中，在DNA聚合酶的催化下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，對引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增通過模板DNA與引物之間的變性、退火和延伸三個步驟為一循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)生的DNA片段作為下次 循環(huán)的模板，所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)增加。多重PCR是在傳統(tǒng)PCR原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，即在同一體系中加入多對特異性引物，對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增出多個目的DNA片段。,多重PCR技術(shù),多重PCR技術(shù),二、多重PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計：大致的如何操作,所要求的東西主要是：菌株、培養(yǎng)基、供試藥物、試劑 培養(yǎng)基：分離培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基 主要試劑：Taq DNA聚合酶，dNTPs 主要儀器：PCR

3、儀、恒壓恒流電泳儀、凝膠成像儀、常溫離心機(jī)、浴式振蕩器、電熱恒溫水浴鍋等等,多重PCR技術(shù),操作方法：第一、多重PCR擴(kuò)增區(qū)域的選擇 由分析目的來決定：缺失分析選擇擴(kuò)增外顯子 法醫(yī)學(xué)鑒定個體差異選擇擴(kuò)增高度多態(tài)性標(biāo)志 微生物鑒別分析可能利用種或株DNA特異性變化區(qū)域 轉(zhuǎn)基因檢測則選擇轉(zhuǎn)入的動植物基因座 性別鑒定一般挑選X或Y性染色體上特有的基因座,多重PCR技術(shù),第二、引物的設(shè)計（關(guān)鍵步驟） 1、引物位置的確定：首先需要知道所選擇的基因引物位點(diǎn)的詳細(xì)DNA序列信息。 引物的DNA序列應(yīng)該有很強(qiáng)的特異性，否則引物會結(jié)合在其他位點(diǎn)上發(fā)生非特異性擴(kuò)增。 2、引物序列的測定：引物的設(shè)計是多重PCR成功

4、的重要保證：事先通過GDB（基因數(shù)據(jù)庫）、NCBI（生物技術(shù)信息中心）查引物相關(guān)位點(diǎn)的DNA序列信息。 3、引物序列的比較：引物間連續(xù)互補(bǔ)不能超過4bp，以防止發(fā)生交叉錯配。,多重PCR技術(shù),多重PCR技術(shù),第三、多重PCR反應(yīng)條件的確定： 首先進(jìn)行單個PCR，分別設(shè)定各引物對反應(yīng)條件。然后，依次增加引物對，不斷調(diào)整反應(yīng)條件直至最后保證所有的引物對都能在同一條件下擴(kuò)增出目的條帶。,多重PCR技術(shù),多重PCR技術(shù)在植物病毒檢測中溫度的確定,多重PCR技術(shù),三、多PCR條件優(yōu)化,多重PCR是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的，但并不是單一PCR的簡單混合，在實(shí)際操作中常常受到反應(yīng)條件和反應(yīng)體系等多

5、種因素的影響。,多重PCR技術(shù),1、反應(yīng)體系優(yōu)化原則,1、確保所有的靶位點(diǎn)可以用相同的PCR程序在單個反應(yīng)中得到有效的擴(kuò)增； 2、在使用相同的PCR程序和反應(yīng)條件的單個PCR中對每對引物的量進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最大的擴(kuò)增效率； 3、平衡多重PCR中每對引物的量，使之對每個靶點(diǎn)都能獲得足夠的擴(kuò)增量。,多重PCR技術(shù),2、引物設(shè)計（關(guān)鍵優(yōu)化）,多重PCR中的每對引物必須滿足單引物PCR體系的引物設(shè)計原則。這些原則包括：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)，長度一般為1530bp，GC含量一般為4060；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。由于多重P

6、CR體系中同時存在多對引物，在引物設(shè)計時還應(yīng)注意：各引物對必須保持高度的特異性，避免非特異擴(kuò)增；盡可能避免所有引物間的相互作用，各引物對應(yīng)保持相對一致的擴(kuò)增效率，且不同引物對擴(kuò)增出來的產(chǎn)物能通過電泳或其他方法區(qū)分開。,多重PCR技術(shù),3、模板核酸的量,模板核酸的量和純度是PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。模板量太少，會出現(xiàn)陰性結(jié)果或條帶很弱；模板量太多則會出現(xiàn)條帶彌散，模糊不清；模板純度低或被降解會導(dǎo)致擴(kuò)增的不整齊。模板核酸片段還必須具有高度的特異性，以避免非特異性擴(kuò)增，保證檢測的準(zhǔn)確性。另外，各片段長度應(yīng)具有明顯差異，以有利于擴(kuò)增后產(chǎn)物的區(qū)分。,多重PCR技術(shù),4、循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化,在傳統(tǒng)PCR反應(yīng)中

7、，一個體系通常采用一個退火溫度。在多重PCR體系中，不同長度的模板核酸片段、不同的引物對所要求的退火溫度不一樣。黃銀花等人通過研究證實(shí)，在15 u L的反應(yīng)體系中含有多個退火溫度的多重PCR反應(yīng)條件的擴(kuò)增效果比采用一個退火溫度的效果好，基本能滿足多重PCR的要求。一般來說，在解鏈溫度Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度。,多重PCR技術(shù),多重PCR的退火時間比傳統(tǒng)PCR稍微延長，有助于引物與模板的完全結(jié)合。延伸時間則要根據(jù)模板核酸的長度決定。黃銀花等經(jīng)過反復(fù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多重PCR的延伸時間比傳統(tǒng)PCR循環(huán)時延伸時間為40s長，他們認(rèn)為循環(huán)時延伸時間為1min的擴(kuò)增效果好，擴(kuò)增產(chǎn)物加尾整齊。

8、,多重PCR技術(shù),5、反應(yīng)體系優(yōu)化,由于多重PCR體系中加入多對引物，因此反應(yīng)體積和反應(yīng)體系中的各成分也應(yīng)做相應(yīng)的調(diào)整。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，20uL與15uL的反應(yīng)體積能達(dá)到多重PCR擴(kuò)增要求，并同時對PCR緩沖液進(jìn)行了改進(jìn)，認(rèn)為多重PCR理想的緩沖液為：1.5mmolLMgCl，50mmolL KCl，10mmolL HCl pH=8.3，1mmolL TMAC，0.01明膠。同時有研究表明，Mg2+濃度與dNTP濃度有相關(guān)性，對于一個25uL的反應(yīng)體系，當(dāng)Mg2+濃度為1.5mmolL時，dNTP推薦濃度為200 u molL。多重PCR反應(yīng)體系中，不同的反應(yīng)會不同程度的競爭DNA聚合酶，

9、因此在反應(yīng)體系中適當(dāng)多加入一些DNA聚合酶，可獲得更佳的擴(kuò)增效果。,多重PCR技術(shù),四、多重PCR的結(jié)果分析,某些多重PCR系統(tǒng)，特別是那些鑒別點(diǎn)突變或其他微小變化的系統(tǒng)，其PCR產(chǎn)物除瓊脂糖電泳外，還需要進(jìn)一步的分析。許多已建立的單個PCR產(chǎn)物分析技術(shù)可以直接應(yīng)用于多重PCR分析，如限制性內(nèi)切酶消化、放射性探針雜交、毛細(xì)管電泳和單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析都可以用來做多重PCR產(chǎn)物的常規(guī)分析。,多重PCR技術(shù),五、多重PCR技術(shù)在食品中的應(yīng)用,多重PCR在食品安全檢測中的應(yīng)用 多重PCR技術(shù)在肉品致病菌檢測中的應(yīng)用 應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測肉品中的致病菌主要是根據(jù)該菌的特異性基因設(shè)計出合適的

10、引物，對基因的高度保守區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。,多重PCR技術(shù),對肉品中單一病原菌的檢測 對于血清型較為復(fù)雜的病原細(xì)菌，如沙門氏菌，致病性大腸桿菌等，采用傳統(tǒng)PCR檢測單一基因片段，特異性不高，影響檢測樣品的有效性。多重PCR技術(shù)針對病原菌多個高度保守的基因序列設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，提高特異性，減少假陽性。,多重PCR技術(shù),多重PCR技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用,應(yīng)用多重PCR方法對感染性疾病病原檢測上要有兩個方法：一是針對每一種病原的單個特異基因進(jìn)多重檢測，同時檢測一種或幾種病原體的存在與否；一是針對某一病原的多個基因進(jìn)行多重檢測，可以減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。,多重PCR技術(shù),可系統(tǒng)組合的有： 肝炎病毒的感染，在同

11、一病人或同一供血者體內(nèi)，有時存在多種肝炎病毒重疊感染，如：甲、乙、丙型肝炎病毒重疊，甲、乙型肝炎病毒重疊，已、丙型肝炎病毒重疊等；腸道斂病性細(xì)菌的檢測，如傷寒、痢疾和霍亂，有時具有較相同的腸道癥狀，有時痢疾、霍亂同一個病人并同時發(fā)??；性傳播疫病：梅毒、淋病及艾滋病的檢測；戰(zhàn)傷細(xì)菌及生物戰(zhàn)劑細(xì)菌的檢測，如破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌等的質(zhì)檢。,多重PCR技術(shù),存在問題和技術(shù)展望,多重PCR在實(shí)際應(yīng)用中一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果：多對引物同時擴(kuò)增，各種試驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物；引物的設(shè)計及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性。此外，對食品樣品進(jìn)行檢測時，增菌培養(yǎng)基選擇