醫(yī)用分子生物學(xué) 討論課 基因組DNA提取 瓊脂糖凝膠電泳 RNA提取

1、分子生物學(xué)討論課匯報展示,1,2,3,4,5,6,7,8,目錄,人類基因組DNA提取 限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,匯報人：,哺乳動物的一切有核細(xì)胞都可以用來制備DNA， 除特殊要求外，白細(xì)胞、肝或脾組織是最常用的 材料。原始材料較少或較難獲得時（如羊水細(xì) 胞），還必須經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細(xì) 胞；有時為了簡便易行起見，還可以無創(chuàng)傷地采 集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞、發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn) 前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細(xì)胞或者絨毛 膜細(xì)胞 SDS是一種去污劑，破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì) 膜； 蛋白酶K是一種很強的蛋白水解酶，能消化各種蛋白質(zhì)（包括糖蛋白和肽類）及脂類 和胺類物質(zhì)，但糖蛋白的降解物常與DN

2、A 一同沉淀下來，干擾酶的活性，消化后需 要用酚、氯仿抽提純化；,人類基因組DNA提取,酚能變性蛋白質(zhì)而且還能將變性的蛋白質(zhì)溶解在 其中； （加入1/3體積的飽和NaCl溶液，也可較好地祛除細(xì) 胞降解物而純化DNA，可以避免酚的污染。） 氯仿也是一種有效的蛋白變性劑，它還能促進兩 相的分離； DNA上清溶液再經(jīng)氯仿抽提后用乙醇沉淀，分離 純化的DNA。,人類基因組DNA提取,人類基因組DNA提取,從全血中提取,1,2,從口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞中提取,人類基因組DNA提取,無水乙醇沉淀時可見白色絮狀物 0.8%瓊脂糖凝聚電泳可見一基因組DNA條帶 OD值測定,人類基因組DNA提取,飽和酚吸取

3、時記得吸取下層的有機相 乙醇沉淀時，要沿離心管壁向DNA溶液中加入無水乙醇，輕輕搖動離心管混合至體系完全均一，見白色絮狀DNA 收集細(xì)胞的多少是實驗成功與否的關(guān)鍵 沉淀中加入1mlSTE后，打散細(xì)胞團便于充分消化細(xì)胞,人類基因組DNA提取,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位 的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 進行切割的一類酶，簡稱限制酶。,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在識別位點上切割DNA分子，

4、然后從底物上解離。 類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoR識別六個核苷酸序列：5- GAATTC-3），有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段（如Sma：5-CCCGGG-3）；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端。,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法,瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果分析 應(yīng)用,匯報人：,1、分析條帶出現(xiàn)拖尾 原因：蛋白質(zhì)沒有去除干凈 2、最下端出現(xiàn)明亮的

5、條帶 原因：樣本中含有RNA,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,3、條帶的粗細(xì) 原因：表明提取出的DNA的多少 4、條帶沒有出現(xiàn) 原因：1）膠太濃了，DNA跑不進來 2） 最后洗膠的時候沖跑了,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,應(yīng) 用,人類基因組研究的一個關(guān)鍵應(yīng)用是通過位置克隆尋找未知生物化學(xué)功能的疾病基因。這個方法包括通過患病家族連鎖分析來繪制包含這些基因的染色體區(qū)域圖，然后檢查該區(qū)域來尋找基因。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,基因組序列的可用性同樣允許疾病基因的旁系同源性的快速識別，對于兩個理由是有價值的。首先，旁系同源基因的突變可以引起相關(guān)遺傳疾病。通過基因組序列使用發(fā)現(xiàn)的一個很好的例子是色盲

6、（完全色盲）。CNGA3基因，編碼視錐體光感受器環(huán)GMP門控通道的a亞單位，顯示在一些色盲家系中存在突變體?；蚪M序列的計算機檢索揭示了旁系同源基因編碼相應(yīng)的b亞單位，CNGB3（在EST數(shù)據(jù)庫中沒有出現(xiàn)）。CNGB3基因被快速認(rèn)定為是其他家系的色盲的原因。另一個例子是由早衰1和早衰2基因提供的，它們的突變可能導(dǎo)致Alzheimer疾病的的早期發(fā)生。第二個理由是旁系同源體可以提供治療敢于的機會，例子是在鐮刀狀細(xì)胞疾病或地中海貧血的個體中試圖再次激活胚胎表達的血紅蛋白基因，它是由于-球蛋白基因突變引起的。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,在過去的世紀(jì)里，制藥產(chǎn)業(yè)很大程度上依賴于有限的藥物靶來開發(fā)新的治療手

7、段。最近的綱要列舉了483個藥物靶被看作是解決了市場上的所有藥物。知道了人類的全部基因和蛋白質(zhì)將極大的擴展合適藥物靶的尋找。雖然，僅僅人類的小部分基因可以作為藥物靶，可以預(yù)測這個數(shù)目將在幾千之上，這個前景將導(dǎo)致基因組研究在藥物研究和開發(fā)中的大規(guī)模開展。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,半胱氨酰基白三烯的收縮和炎癥作用，先前認(rèn)為是過敏反應(yīng)的慢反映物質(zhì)（SRS-A），通過特定的受體介導(dǎo)。第二個類似的受體，CysLT2，使用老鼠EST和人類基因組序列的重組得到識別。這導(dǎo)致了與先前識別的唯一的其它受體有38%氨基酸一致性的基因的克隆。這個新的受體，顯示高的親和力和幾個白三烯的結(jié)合，映射在與過敏性哮喘有關(guān)的第13

8、號染色體區(qū)域上。這個基因在氣道平滑肌和心臟中表達。作為白三烯途徑中抗哮喘藥物開發(fā)中一個重要的靶，新受體的發(fā)現(xiàn)有明顯的重要的作用,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,人體基因組圖譜是全人類的財產(chǎn)，這一研究成果理應(yīng)為全人類所分享、造福全人類，這是參與人類基因組工程計劃的各國科學(xué)家的共識。值得關(guān)注的是，目前在人類基因組研究領(lǐng)域，出現(xiàn)了一些私營公司爭相為其成果申請專利的現(xiàn)象。美國塞萊拉基因公司曾表示，想把一部分研究成果申請專利，有償提供給制藥公司。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,找到了一批主宰人體疾病的重要基因如：肥胖基因、支氣管哮喘基因。這類基因的新發(fā)現(xiàn)每年都有新報道。這些基因的發(fā)現(xiàn)，增進了人們對許多重要疾病機理的理解，

9、并且推動整個醫(yī)學(xué)思想更快的從重治療轉(zhuǎn)向重預(yù)防。例如：湖南醫(yī)科大學(xué)夏家輝教授組于1998.5.28發(fā)表克隆了人類神經(jīng)性高頻性耳聾的致病基因（GJB3），這是第一次在中國克隆的基因。,瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取 RT-PCR的原理、方法,匯報人：,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取,真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中總RNA主要由rRNA、 tRNA和核內(nèi)小分子RNA、mRNA 組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取,破碎組織 分離RNA 沉淀RNA洗滌RNA 融解RNA保存RNA,破碎：可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白 酶K等破碎組織 加入 -ME可以抑制RN

10、A酶活性 分離：一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊 醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層， 與蛋白層分開。一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊 醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層， 與蛋白層分開。 沉淀：一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。 洗滌：使用70乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉， 此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干 乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。 溶解：一般使用TE。 保存：應(yīng)該盡量低溫,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取,分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況 獲得新基因 研究基因的拼接 分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物,人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取,即逆轉(zhuǎn)錄PCR，提取組織或細(xì)

11、胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。,RT-PCR的原理、方法,RT-PCR的原理、方法,提取總 RNA,合成 cDNA,PCR,RT-PCR的原理、方法,RT-PCR的原理、方法,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (RT),RT-PCR的原理、方法,PCR,瓊脂糖凝膠電泳 結(jié)果分析 應(yīng)用,匯報人：,哺瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:它兼有分子篩和電泳的雙重作用。,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析,數(shù)量,質(zhì)量,條帶的寬度 熒光的亮度,純 度 分子量,結(jié)果初步分析,人類基因組的