細(xì)胞電生理學(xué)與膜片鉗技術(shù)ppt課件

1、2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用,3、膜片鉗系統(tǒng)裝置,1、細(xì)胞電生理學(xué),OUTLINE,小林/forry 祝你科研學(xué)習(xí)順利,膜片鉗實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)備,膜片鉗放大器 信號(hào)轉(zhuǎn)換器 倒置顯微鏡 微操縱器 防震工作臺(tái)及靜電屏蔽籠 微電極拉制儀及拋光儀 計(jì)算機(jī) 專用軟件 細(xì)胞記錄槽 恒速灌流泵,Automatic Patch Clamp Robot,原理：硅硼玻璃制造的芯片對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行鉗制。芯片上有約1m的孔，從芯片內(nèi)側(cè)用泵施以負(fù)壓使懸浮細(xì)胞被吸引到開孔處而形成封接。,膜片鉗記錄的基本步驟,可概括為4大部分： 1.液體配制。主要根據(jù)研究通道的不同，配制相應(yīng)的液體，基本原則是保持2個(gè)平衡：滲透壓平衡和酸堿平衡。 2.

2、標(biāo)本的制備。膜片鉗記錄標(biāo)本的制備主要有：急性分離、細(xì)胞培養(yǎng)、腦片或其它組織薄片。當(dāng)根據(jù)不同的研究要求而相應(yīng)選擇。 3.膜片鉗記錄 4. 資料分析用相應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行,3.膜片鉗記錄,電極拉制：一般采用常規(guī)二步法完成，電極尖端直徑在0.5-2.0m之間，是否涂膠與拋光應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定，不必強(qiáng)求。 億歐姆封接：電極充灌安裝后即給持續(xù)正壓，在倒置顯微鏡監(jiān)視下將電極貼近細(xì)胞，以微操縱器將電極貼于細(xì)胞，去掉正壓后再稍施負(fù)壓吸引，億歐姆封接便瞬間形成。要保證億歐姆封接就必須做到： 1)電極電阻適當(dāng)；2)電極尖端清潔；3)電極氣路通暢； 4)電極與細(xì)胞相貼寧不及而勿過之； 5)細(xì)胞膜清潔，活性好。,4.資料

3、分析,一般電學(xué)性質(zhì)：通過I/V關(guān)系計(jì)算單通道電導(dǎo)，觀察通道有無整流。通過離子選擇性、翻轉(zhuǎn)電位或其它通道激活條件初步確定通道類型。 通道動(dòng)力學(xué)分析：開放時(shí)間、開放概率、關(guān)閉時(shí)間、通道的時(shí)間依賴性失活、開放與關(guān)閉類型(簇狀猝發(fā)，Burst)樣開放與閃動(dòng)樣短暫關(guān)閉(flickering)，化學(xué)門控性通道的開、關(guān)速率常數(shù)等。 藥理學(xué)研究： 研究的藥物，阻斷劑、激動(dòng)劑或其它調(diào)制因素對(duì)通道活動(dòng)的影響情況。 綜合分析得出最后結(jié)淪,膜片鉗在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用,膜片鉗技術(shù)不僅對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展以及對(duì)于闡明各種疾病的機(jī)制具有革命性意義，而且開辟了一條探索藥物作用機(jī)制和發(fā)展新的更為有效藥物的途徑。正如諾貝爾基

4、金會(huì)在頒獎(jiǎng)時(shí)所說:“Neher和Sadmann的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機(jī)理,為研制新的更為特效的藥物開辟了道路” 。,膜片鉗技術(shù)的一大優(yōu)點(diǎn)就是在通道電流記錄中,可分別于不同時(shí)間、不同部位(膜內(nèi)或膜外)施加各種濃度的藥物或毒素,研究它們對(duì)通道功能的可能影響。通過研究,一方面可深入了解哪些選擇性作用于通道的藥物和毒素影響人和動(dòng)物生理功能的分子機(jī)理;另一方面,分析各種藥物對(duì)通道蛋白的選擇性相互作用的特點(diǎn),提供有關(guān)通道蛋白亞單位結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的信息。,藥物作用機(jī)制研究,膜片鉗技術(shù)對(duì)離子通道的動(dòng)力學(xué)研究以及藥物與通道相互作用機(jī)制的研究。 藥物對(duì)通道電壓依賴的激活和滅活過程的影響 藥物對(duì)離子通道狀態(tài)依賴性

5、的作用（如大多數(shù)類抗心律失常藥與失活狀態(tài)的Na+通道結(jié)合而發(fā)揮作用）。 藥物的頻率依賴性（frequency-dependent）或使用依賴性（use-dependent）（如維拉帕米）以及藥物對(duì)離子通道亞型的選擇性作用等 。,膜片鉗技術(shù)還在作用于通道活性受體和第二信使調(diào)節(jié)的藥物的機(jī)制研究中發(fā)揮了重要作用。如證明了腎上腺素能介質(zhì)及藥物激活受體后，通過第二信使cAMP激活蛋白激酶A，使鈣通道磷酸化，由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)為開放。,新藥開發(fā),在現(xiàn)代藥物研究中，新靶點(diǎn)的建立往往是新藥創(chuàng)制的前提。隨著膜片鉗技術(shù)運(yùn)用對(duì)許多新受體亞型的發(fā)現(xiàn)和特性研究，新型受體阻斷劑將在選擇性 、高效性上發(fā)揮更大的作用。,近十年來藥

6、物學(xué)研究最重要的成就之一就是首先合成了各類鈣拮抗劑(如硝苯砒啶、硫氮卓酮和維拉帕米及其衍生物) 。 研制出鉀通道開放劑（nicorandil、pinacidil等） 類抗心律失常新藥是近年來心血管藥理的重要研究方向 。,離子通道病及與離子通道調(diào)節(jié)缺陷有關(guān) 疾病的研究。 將基因工程與膜片鉗技術(shù)結(jié)合起來,把通道蛋白有目的地重組于人工膜中進(jìn)行研究。設(shè)想將合成的通道蛋白分子接種入機(jī)體以替換有缺陷和異常的通道的功能而達(dá)到治療的目的。,離子通道藥理學(xué),離子通道藥理學(xué),Patch-clamp技術(shù),新藥開發(fā),Na+,Ca2+,K+,Cl-等電流,分子生物學(xué)技術(shù),單細(xì)胞電流記錄,離子通道的結(jié)構(gòu)與功能,藥物作用機(jī)

7、制,基因克隆及蛋白表達(dá),通道蛋白功能測(cè)定,一、離子選擇性(selectivity )（大小和電荷）： 某一種離子只能通過與其相應(yīng)的通道跨膜擴(kuò)散(安靜：KNa 100倍、興奮： NaK 10-20倍）；各離子通道在不同狀態(tài)下，對(duì)相應(yīng)離子的通透性不同。 二、門控特性(Gating)： 失活狀態(tài)不僅是通道處于關(guān)閉狀態(tài)，而且只有在經(jīng)過一個(gè)額外刺激使通道從失活關(guān)閉狀態(tài)進(jìn)入靜息關(guān)閉狀態(tài)后，通道才能再度接受外界刺激而激活開放。,二、離子通道的特性(Characteristic of Ion Channels),(參見P27圖24-1),三、離子通道的功能(Function of Ion Channels),

8、1.產(chǎn)生細(xì)胞生物電現(xiàn)象,與細(xì)胞興奮性相關(guān)。 2.神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、腺體的分泌、肌肉的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)和記憶 3.維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能完整性,膜離子通道的基因變異及功能障礙與許多疾病有關(guān)，某些先天性與后天獲得性疾病是離子通道基因缺陷與功能改變的結(jié)果，稱為離子通道病 (ionchannelpathies)。,四、Classification of ion channels,（一）、非門控離子通道 （背景或漏通道）： 始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時(shí)進(jìn)出細(xì)胞，并不受外界信號(hào)的明顯影響，如產(chǎn)生靜息電位的K+通道。 （二）、門控離子通道： 電壓門控（Voltage gated channels)離子通道：受膜電位

9、的變化影響，如決定細(xì)胞興奮性、不應(yīng)期和傳導(dǎo)性的K+通道、Na+通道、Ca2+通道。 配體門控（Ligand gated channels)離子通道：由遞質(zhì)與通道蛋白分子上結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合開啟，如乙酰膽堿激活鉀通道等。 機(jī)械門控離子通道(Mechanically gated ion channels)：由機(jī)械牽拉激活，如內(nèi)耳毛細(xì)胞頂端機(jī)械門控通道。,電壓門控離子通道的分子結(jié)構(gòu)示意圖,亞基 (,等） 亞基的四個(gè)跨膜區(qū)（D1-D4）,離子通道的晶體結(jié)構(gòu)與模型,鉀離子,孔道螺旋,選擇性過濾器,N,C,（一）電壓門控離子通道的分類,快反應(yīng)細(xì)胞AP and Ion channels,0,1,2,3,4,IN

10、a,ICa,IKr,IKs,1.電壓門控鈉通道,選擇性允許Na+跨膜通過。維持細(xì)胞膜興奮性及其傳導(dǎo)（AP的0相）。存在于心房、心室肌細(xì)胞和希普系統(tǒng)。,特征 電壓依賴性：去極化激活，產(chǎn)生內(nèi)向鈉電流（INa） 快速激活（1ms）和快速失活（10ms） 有特異性激活劑（BTX、GTX）和阻滯劑（TTX、STX、CTX）,電壓門控鈉通道分類,神經(jīng)類鈉通道（對(duì)TTX敏感性高、對(duì)CTX敏感性低） 骨骼肌類鈉通道（對(duì)TTX和CTX敏感性均高） 心肌類鈉通道（對(duì)TTX和CTX敏感性均低），又分為持久（慢）鈉通道和瞬時(shí)（快）鈉通道。,2.電壓門控鈣通道,鈣通道存在于機(jī)體各種組織細(xì)胞，在正常情況下為細(xì)胞外Ca2+

11、內(nèi)流的離子通道（AP平臺(tái)期），是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（Ca2+i）的主要途徑。,特征: 電壓依賴性：去極化激活 緩慢激活（20-30ms）和緩慢失活（100-300ms）：在心肌細(xì)胞上，當(dāng)鈣通道尚未激活時(shí)，鈉通道已經(jīng)失活。 對(duì)離子的選擇性較低：在細(xì)胞外Ca2+濃度（Ca2+o）下降時(shí)，也允許Na+通過。,電壓門控鈣通道,目前已克隆出L、T、N、P、Q和R6種亞型的電壓依賴性鈣通道，心血管系統(tǒng)主要有L-型和T-型。,3. 電壓門控鉀通道,選擇性允許K+跨膜通過的離子通道(參于RP、心率、APD調(diào)節(jié)）。是目前發(fā)現(xiàn)的亞型最多、作用最復(fù)雜的一類離子通道。,1.瞬時(shí)外向鉀通道電流（Ito）： Ito1

12、（不依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，對(duì)4-AP敏感）是復(fù)極1期的主要參與電流。 Ito2（依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，對(duì)4-AP不敏感）可能是減少鈣超載的一種負(fù)反饋機(jī)制（縮短動(dòng)作電位時(shí)程）。,2.延遲整流鉀通道電流（IK）：緩慢成分（IKs）和快速成分（IKr）是AP2、3相的主要復(fù)極電流。類抗心律失常藥物選擇性阻滯IKr，使動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)。超快速成分（IKur）對(duì)心房肌復(fù)極重要，與房性心律失常有關(guān)。 3.內(nèi)向整流鉀通道電流（IK1）：IK1主要參與AP3相復(fù)極晚期及4相RP的維持。 4.起搏電流（If）：If由K+和Na+共同攜帶的離子電流。腎上腺素使If電流增加，交感神經(jīng)刺激加快心率,乙酰膽堿可抑制If，迷

13、走神經(jīng)減慢心率。,電壓門控鉀通道,（二）配體門控離子通道,當(dāng)配體與配體門控離子通道結(jié)合后，引起通道蛋白構(gòu)型變化，致通道開放。 心血管系統(tǒng)主要有: 1.乙酰膽堿激活鉀通道(KACh)：參與迷走調(diào)控。 2. ATP敏感鉀通道(KATP)：心肌缺血、缺氧開放。 3.鈣激活鉀通道(KCa)：參與血管張力調(diào)控。,配體門控離子通道,Classification of ion channels(離子通道的分類),（一）、非門控離子通道 （背景或漏通道）： 始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時(shí)進(jìn)出細(xì)胞，并不受外界信號(hào)的明顯影響，如產(chǎn)生靜息電位的K+通道。 （二）、門控離子通道： 電壓門控（Voltage gated

14、channels)離子通道：受膜電位的變化影響，如決定細(xì)胞興奮性、不應(yīng)期和傳導(dǎo)性的K+通道、Na+通道、Ca2+通道。 配體門控（Ligand gated channels)離子通道：由遞質(zhì)與通道蛋白分子上結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合開啟，如乙酰膽堿激活鉀通道等。 機(jī)械門控離子通道(Mechanically gated ion channels)：由機(jī)械牽拉激活，如內(nèi)耳毛細(xì)胞頂端機(jī)械門控通道。,第二節(jié) 作用于心血管系統(tǒng)離子通道的藥物Drugs used in cardiovascular ion channels,作用于鈉通道的藥物 作用于鉀通道的藥物 作用于鈣通道的藥物,一、作用于鈉通道的藥物 The d

15、rugs used in sodium channel,作用于鈉通道的藥物主要是鈉通道阻滯藥，臨床常用的有局部麻醉藥、抗癲癇藥和類抗心律失常藥。,二、作用于鉀通道的藥物The drugs used in potassium channel,作用于鉀通道的藥物被稱為鉀通道調(diào)控劑，包括鉀通道阻滯藥（阻滯細(xì)胞內(nèi)K+外流）和鉀通道開放藥（促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)K+外流）。 鉀通道阻滯藥（Potassium channel blockers,PCBs）是一類可抑制K+通過膜不同鉀通道亞型的化合物。包括非選擇性PCBs（四乙基銨、4-氨基吡啶）和選擇性PCBs（磺酰脲類降糖藥、類抗心律失常藥）。,鉀通道開放藥（PCO

16、s）是選擇性作用于鉀通道，增加細(xì)胞膜對(duì)K+的通透性，促進(jìn)K+外流)的一類藥物。 促細(xì)胞內(nèi)K+外流，膜超級(jí)化，降低鈣通道開放、阻止Ca2+ 的重?cái)z取、儲(chǔ)存和釋放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+下降。均作用于KATP ，舒張血管平滑肌。 按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為7組: (1)苯并吡喃類:克羅卡林 (5)苯并噻二嗪類：二氮嗪 (2)吡啶類：尼可地爾 (6)硫代甲酰胺類：RP25891 (3)嘧啶類：米諾地爾 (7)1,4二氫吡啶類：尼古地平 (4)氰胍類：吡那地爾,Potassium channel opener鉀通道開放藥（PCOs）,【藥理作用與臨床應(yīng)用】,高血壓：高選擇性地舒張阻力血管(強(qiáng)，吡那地爾和米諾地爾）。 心絞痛和心肌梗死：高選擇性地?cái)U(kuò)張正常及有病變的冠脈，改善冠脈血供(尼可地爾)。 心肌保護(hù)作用：使缺血心肌細(xì)胞膜超極化，恢復(fù)紊亂的電解質(zhì)平衡，減輕Ca2+超載。 充血性心衰：降低安靜及運(yùn)動(dòng)時(shí)的左、右心室負(fù)荷(尼可地爾) 。,Potassium channel opener鉀通道開放藥（PCOs）,鈣通道阻滯藥(Calcium channel blockers)/鈣拮抗藥(calcium antagoni