現(xiàn)代科技綜述知識文庫：植物抗病基因工程的研究進(jìn)展

1、現(xiàn)代科技綜述系列植物抗病基因工程的研究進(jìn)展科技是人類區(qū)別于動物的重要文明之一，是人類對自然規(guī)律研究和利用的學(xué)科。本文提供對科技基本概念“植物抗病基因工程的研究進(jìn)展”的解讀，以供大家了解。植物抗病基因工程的研究進(jìn)展植物病害數(shù)目多達(dá)數(shù)百種，幾乎所有作物在生長期內(nèi)都會遭受到不同程度的危害。就主要作物之一的水稻而言，每年遭受病害的損失就達(dá)數(shù)十億美元。怎樣有效地防治植物病害，減少巨大損失，滿足日益增長的世界人口需求，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的當(dāng)務(wù)之急，而防治植物病害的根本途徑歸根到底依賴于培育抗病品種。采用常規(guī)方法進(jìn)行抗病育種，不僅受到物種間的限制，而且要固定一個(gè)抗病性狀進(jìn)入栽培品種費(fèi)時(shí)巨大，常常需要10年之久，何

2、況要尋找一個(gè)具有獨(dú)立抗病性狀的物種也是非常困難的?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，使得將外源抗性基因?qū)朐耘嗥贩N，賦予其特定抗病性成為可能，從而大大加速了抗病育種的進(jìn)程，開辟了抗病育種的新時(shí)代。目前針對單鏈RNA病毒，采用的外殼蛋白基因途徑比較成熟，一些重組植株已進(jìn)入大田試驗(yàn)，可望在20世紀(jì)末應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；而針對不同病菌(細(xì)菌、真菌)的固有特性，采用不同策略的抗病基因工程正在發(fā)展中，可望近期內(nèi)有所突破。抗病毒基因工程 1外殼蛋白途徑。1986年Beachy研究小組首次將煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因(CP基因)導(dǎo)入煙草，培育出抗TMV的煙草植株。開創(chuàng)了抗病育種的新紀(jì)元。至今采用這一途徑，針對黃瓜花葉

3、病毒(CMV)，苜蓿花葉病毒(ALMV)，馬鈴薯X病毒(PVX)，馬鈴薯Y病毒(PVY)，煙草線條病毒(TSV)，煙草脆裂病毒(TRV)，水稻條紋葉枯病毒(RSV)等主要病毒，成功地構(gòu)建出各種抗病毒工程植株。這些表達(dá)病毒外殼蛋白基因的植株其抗病程度與細(xì)胞中該基因的表達(dá)水平一般成正比，即外殼蛋白基因的表達(dá)水平越高，其抗病力越強(qiáng)。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物還能交叉保護(hù)其它株系或相關(guān)病毒的侵染；田間試驗(yàn)表明這些工程植株的抗病性與室內(nèi)相當(dāng)，農(nóng)藝性狀與對照無明顯差異。Nelson等對轉(zhuǎn)TMV CP基因的重組番茄進(jìn)行田間試驗(yàn)，結(jié)果對照幾乎100%都發(fā)生癥狀，果實(shí)減產(chǎn)26%35%，而轉(zhuǎn)基因番茄(VF36)發(fā)病

4、率僅為5%，產(chǎn)量幾乎不受影響；同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)，表達(dá)TMV的UICP基因的重組番茄能交叉保護(hù)TMVmPV230的3個(gè)強(qiáng)株系的感染。這些結(jié)果都顯示出外殼蛋白途徑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治病毒病的潛在威力。第一批轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)歷了室內(nèi)、溫室、田間試驗(yàn)后，在1995年前后將應(yīng)用于大田生產(chǎn)。2其它途徑。除了外殼蛋白這一有效途徑外，近來還開創(chuàng)出多種抗病毒基因工程的新方法。1986年Baulcome等成功地將CMV衛(wèi)星RNA導(dǎo)入煙草，獲得的表達(dá)全長序列衛(wèi)星RNA的工程煙草植株，對該病毒或相關(guān)病毒的復(fù)制和癥狀表現(xiàn)有抑制效果。1988年，Yamaya等獲得了表達(dá)TMV弱毒株完整基因組的工程植株，這種植株生長正常，不表現(xiàn)明顯

5、癥狀，而對TMV有交叉保護(hù)作用，且其保護(hù)作用比表達(dá)外殼蛋白植株的強(qiáng)。但是上述這2種重組植物都成了病毒“貯存庫”，弱毒株、衛(wèi)星RNA都有突變成強(qiáng)致病力株系的危險(xiǎn)，因此有必要構(gòu)建缺失突變株才能很好地克服這些潛在缺陷。1990年，Golemoboski等將TMV ul株系的非結(jié)構(gòu)基因(54KD基因)導(dǎo)入煙草，獲得了對TMV免疫性抗性的工程植株，引起了人們對病毒非結(jié)構(gòu)基因的極大興趣。但54KD基因重組植物的比較專一的獲得抗性若變得廣譜一些，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用價(jià)值會更大。以上是利用病毒基因組的有用基因的研究，抗病毒基因工程的有用基因的另一部分是來自植物等生物體的基因，例如病毒復(fù)制抑制因子、致病相關(guān)蛋白、抗

6、體、核酶的基因等。其中致病相關(guān)蛋白工程已獲得了重組植株，只是抗性不理想；而病毒復(fù)制抑制因子、抗體、核酶等工程的設(shè)想很好，展現(xiàn)出許多誘人的前景，但目前還處于起步階段，還有一些需要解決的技術(shù)難題。采用基因工程使植物獲得抗病毒性能有多種途徑，歸結(jié)起來，基因的來源有來自病毒本身的，也有來自植物等生物體的；其作用機(jī)制有影響病毒復(fù)制的，也有影響其轉(zhuǎn)移的，但至今還是利用病毒外殼蛋白基因策略的效果最好。盡管如此，這種轉(zhuǎn)基因植株也只是遲延一年生植物的病毒病的發(fā)生，而且目前能轉(zhuǎn)移基因的主要是RNA病毒，因此植物抗病毒基因工程還有許多問題有待解決?？共【蚬こ?1單一基因控制的抗性。植物病原細(xì)菌、真菌具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)

7、，且侵染致病機(jī)制復(fù)雜，這就給用生物技術(shù)來防治這二大類病害帶來了困難。植物與病原菌相互關(guān)系的分子基礎(chǔ)研究，為用基因工程技術(shù)培育抗病菌工程植株積累了知識，目前抗病菌基因工程已經(jīng)展開，并取得了一些有意義的進(jìn)展。煙草野火病菌(Pseudomonas syringae pvtabaci)侵染煙草葉片后，產(chǎn)生一種細(xì)菌毒索即煙毒(tabtoxin)，干擾寄主細(xì)胞代謝并間接影響葉綠素的合成，形成野火病癥。日本人率先從該菌中分離出解毒基因，并導(dǎo)入煙草，獲得的重組植物能降解該菌分泌的煙毒素，不形成病班。最近Herrera-Estrella等報(bào)道了類似的結(jié)果，他們將抗phaseolotoxin基因?qū)霟煵?，獲得了耐

8、phaseolotoxin、并抗該菌侵染的工程煙草植株。針對病原菌的致病毒素，克隆解毒基因采用基因工程技術(shù)來培育抗病品種是抗菌工程的可行途徑。但是針對寄主特異性毒素，從其分泌菌中分離其解毒基因的努力，多年來卻未能如愿以償，確是一件遺憾的事。水解酶尤其是幾丁質(zhì)酶在體外具有抑制病原菌生長的生物活性。1991年，Broglie等將蠶豆的幾丁質(zhì)酶基因與強(qiáng)啟動子CaMV35S連接，在煙草和蕪菁中得到了高效表達(dá)，獲得的抗性植株顯著抑制病原真菌(Rhizoctonia solani)的生長，延遲了立枯病的出現(xiàn)。蠶豆與煙草的幾丁質(zhì)酶性質(zhì)有所不同，如底物特異性、Vmax和Km、穩(wěn)定性等，也許正是由于病原菌與所不

9、熟悉的丁質(zhì)酶相遇才導(dǎo)致植物抗病性的出現(xiàn)。將煙草的堿性液泡幾丁酶基因轉(zhuǎn)入近緣種的煙草中，雖然獲得了高效表達(dá)，卻沒有表現(xiàn)出對Cercospora nicotianae的有效的保護(hù)作用。核糖體滅活蛋白(RIP)來自植物，是一類作用于真核生物細(xì)胞核糖體、抑制蛋白質(zhì)合成的蛋白毒素。RIP不滅活自身的核糖體，卻能特異性地作用于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種類，如真菌的核糖體。1992年，Schell等將受控于傷誘導(dǎo)啟動子的大麥RIP cDNA導(dǎo)入煙草，獲得能抗土壤病原真菌Rhizoctonia solani的重組植株。在此例中，外源RIP在寄主細(xì)胞中未表現(xiàn)出毒性，轉(zhuǎn)基因煙草仍能生長、傳代。但RIP對宿主細(xì)胞的潛在毒性依

10、然存在，這一點(diǎn)要特別注意，這是確保RIP在作物防衛(wèi)中的成功應(yīng)用的關(guān)鍵。在策略上可以通過使RIP分泌到胞外或液泡中，或是設(shè)計(jì)成誘導(dǎo)型表達(dá)，來減輕RIP產(chǎn)生的宿主毒害作用。另外，幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶具有降解真菌細(xì)胞壁，抑制真菌生長的功能，如果RIP與這兩種酶協(xié)同作用，也許會顯著提高抗菌或抗病能力?？剐曰虿粌H來自高等植物和病原菌，例如，來自牛的溶菌酶，在體外對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌有抗性，包括農(nóng)桿菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬等的一些植物病原菌。初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，讓牛的溶菌酶基因在煙草中表達(dá)，對野火病菌的侵染有一定的抵抗作用。尋找抗菌基因進(jìn)行抗病基因工程是一項(xiàng)長期而艱巨的任務(wù)。作者等曾從對水稻白葉枯病菌

11、拮抗作用很強(qiáng)的芽孢桿菌中純化出幾種抗菌蛋白，將編碼這些抗菌蛋白的基因?qū)胨局谱髦亟M植株的工作還在進(jìn)行中，效果如何倍受關(guān)注。2多基因控制的抗性。植保素(phytoalexin)和木質(zhì)素在細(xì)胞內(nèi)的積累或在細(xì)胞壁上的沉積直接表現(xiàn)為抗病效應(yīng)，而它們的生物合成和沉積過程是受多基因控制的。弄清其生物合成途徑，找出協(xié)調(diào)多個(gè)相互獨(dú)立的防衛(wèi)基因的調(diào)控基因，是調(diào)控多基因防衛(wèi)系統(tǒng)，提高抗病效果的關(guān)鍵。PAL(phenylalanine ammonialyase)是合成木質(zhì)素單體以及某些植保素(pterocarpans and furanocoumarins)的關(guān)鍵酶。對含PAL基因的重組植物的分析結(jié)果表明，PAL

12、基因表達(dá)水平高的植物中phenylpropanoid積累和抗菌活力都得以增加；此外，表達(dá)peroxidase基因的重組煙草體內(nèi)不僅該酶的活力大大增加，而且還增加了對Peronosporaparasitica的抗性。植物病原菌常常不能耐受非寄主植物的phytoalexin，因此，讓病原菌與非寄主的phytoalexin相遇，是提高植物抗性的又一條新路子。將花生的stibene基因?qū)霟煵?，結(jié)果在煙草中合成了新的phytoalexin resveratrol。但是，還未見這種新的phytoalexin對提高抗性的效果究竟如何的報(bào)道。近來不少研究進(jìn)行了這方面的探索，這不僅在抗病育種方面有重要價(jià)值，而

13、且是對研究phytoalexin生物合成機(jī)制的貢獻(xiàn)。位于植物細(xì)胞壁中的負(fù)電性過氧化物酶(peroxidase)，能催化產(chǎn)生酚基以形成木質(zhì)素的氧化型聚合物，另外也可能參與與保衛(wèi)機(jī)制有關(guān)的胞壁結(jié)構(gòu)蛋白交聯(lián)反應(yīng)。往煙草中導(dǎo)入番茄的過氧化物酶基因，在其自身的啟動子或CaMV35S啟動子的控制下過氧化物酶活性大大增加，同時(shí)也加強(qiáng)了對Peronospora parasitica的抗性，抑制了病癥的發(fā)展和病原真菌的孢子形成。在植物抗病保衛(wèi)機(jī)制被激活的初期，信號的識別和傳導(dǎo)是非常重要的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，十八肽systemin是在植物受傷后誘導(dǎo)全株性保衛(wèi)機(jī)制的信號分子；而水楊酸則是由過敏性環(huán)死引發(fā)全身性保護(hù)反應(yīng)的信號

14、傳遞因子，它在煙草內(nèi)的受體是一種約650KD的可溶性多聚體。在信號傳導(dǎo)與信號響應(yīng)過程中，常伴隨著胞內(nèi)外離子濃度的改變。當(dāng)植保素被激發(fā)合成時(shí)，先出現(xiàn)氫離子的內(nèi)流和鉀離子的外流，隨即出現(xiàn)鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致胞液中植保素含量增加。進(jìn)一步弄清其內(nèi)在機(jī)制，對開辟新的抗病工程途徑尤為重要。抗菌基因工程經(jīng)歷幾年的徘徊之后，終于走出了低谷，近來?？梢姷揭恍┏晒Φ膱?bào)道。只要加強(qiáng)植物與病原菌相互作用的分子基礎(chǔ)研究，加強(qiáng)重組植物中抗性基因跟蹤分析，就一定能用生物技術(shù)制作出能在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的抗病原菌的重組植物新品種。我國的現(xiàn)狀及存在問題 1現(xiàn)狀。80年代中期特別是實(shí)施863計(jì)劃以來，根據(jù)Beachy的外殼蛋白途徑，以流

15、行于我國的主要農(nóng)業(yè)病毒為材料，克隆外殼蛋白基因，進(jìn)行抗病毒工程，培育出抗TMV、CMV等病毒的工程煙草植株，目前已進(jìn)入規(guī)模大田試驗(yàn)；與此同時(shí)也成功地構(gòu)建出能表達(dá)CMV衛(wèi)星RNA的重組植株，也表現(xiàn)良好的抗CMV特性，這些都大大縮短了我們與世界的距離。在抗細(xì)菌病基因工程方面，我們把精力集中在抗菌蛋白途徑上，純化出一批抗菌蛋白，可至今未見有表達(dá)抗菌蛋白的重組植物的報(bào)告。在抗真菌病基因工程方面進(jìn)展不大，有待進(jìn)一步加強(qiáng)?？共』蚬こ萄芯坎粌H可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供具有特定抗病性的品種，而且是植物與微生物相互作用分子基礎(chǔ)研究、分子生物學(xué)、基因工程方面綜合國力的顯示，因此有必要進(jìn)一步加強(qiáng)。2存在問題。(1)基因工

16、程與基礎(chǔ)研究。近幾年來我們習(xí)慣于運(yùn)用基因操作技術(shù)，以我國的生物資源為材料，克隆國外已有的基因，這對趕上世界水平起到了一定的作用。但我們不能滿足于此，必須基礎(chǔ)研究與基因工程并重。在進(jìn)行基因工程的同時(shí)加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，深入研究植物與微生物相互作用的分子基礎(chǔ)，去創(chuàng)造新的抗病途徑；深入研究重組植物的抗病機(jī)制，去發(fā)展現(xiàn)有的抗病途徑。只有這樣我們的研究才真正有生命力。否則的話與世界縮短了的距離還會拉大。(2)基因工程與常規(guī)農(nóng)業(yè)技術(shù)。采用基因操作獲得的只是一種人工種質(zhì)新材料，而不是生產(chǎn)上可以立即應(yīng)用的新品種。必須經(jīng)過常規(guī)的育種程序，將重組植物的外源基因穩(wěn)定延續(xù)給后代或通過有性繁殖轉(zhuǎn)移至其它品種，此后該品種還必須

17、在合理的栽培措施的緊密配合下，才能實(shí)現(xiàn)最終價(jià)值。運(yùn)用基因工程技術(shù)進(jìn)行的抗病育種，并不是一個(gè)單一的技術(shù)，而是多學(xué)科(分子生物學(xué)、基因工程、植物病理、遺傳育種、組織培養(yǎng)等)的緊密合作才能完成的工作。必須將生物技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)合理配合，科學(xué)組裝，才能有效地解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的問題。(3)基因工程與環(huán)境生態(tài)平衡。前幾年由于遺傳工程生物體野外試驗(yàn)法規(guī)尚不健全，重組植物很容易進(jìn)入大田試驗(yàn)，這為我國在這方面的研究趕上世界水平開了綠燈。但基因工程技術(shù)在帶來明顯經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)，亦有可能帶來一些潛在問題。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國、一個(gè)發(fā)展中的國家，還是要有個(gè)法規(guī)，加強(qiáng)管理，以防萬一。固然作物的生長位置較為固定，且多為一年生植

18、物，加之目前導(dǎo)入的幾乎都是單基因，但并不等于就沒有問題。對特定的基因工程生物體在非受控條件下可能造成的生態(tài)后果必須加強(qiáng)研究，作出較可靠的預(yù)測及綜合的生態(tài)評價(jià)后，再在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上推廣應(yīng)用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】： 1 Powell Abel P,et al. Science. 1986,232 : 738743 2 Nelson R S,et al. Bio/Technology. 1988,6:403 409 3 Loesch-Fries L S,et al. EMBOJ. 1987,6:1845 1852 4 Baulcombe DC,et al. Nature. 1986,321:446449 5 Y

19、amaya J,et al. Mol. Gen. Genet. 1988,315:173175 6 Golemboski D B,et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990,87: 63116315 7 Cutt J R,et al. Virology. 1989,173:8997 8 Anzai H,et al. Mol. Gen. Genet, 1989,219:492494 9 Fuente-Martinez J M,et al. Bio-Technology,1992,10:905 909 10 Broglie K,et al. Science,19