地高辛標記探針的Southern-雜交技術

1、地高辛標記探針的Southern 雜交技術根據(jù)核酸變性與復性的特性，特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA能夠在一定條件下與具有互補性的核酸鏈退火形成雙鏈結構，稱之為核酸雜交。將已知的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA進行標記，制成核酸探針，就可以用它檢測樣品中是否存在同源序列，或確定不同物種之間的親緣關系，已成為分子生物學中一類重要的檢測手段，在科學研究和實踐中具有十分廣泛的用途。它可用于基因組特定DNA序列的定位，測定相關片段的同源性、從cDNA文庫、基因組文庫中篩選完整基因等。還可以用于構建DNA分子的酶切圖譜和遺傳圖指紋分析等。核酸雜交檢測都是在濾膜上進行的，常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維

2、素濾膜等。其基本過程包括以下幾步。首先將待檢樣品DNA或RNA分子直接點加到濾膜上，或經(jīng)過凝膠電泳分離再通過毛細管作用或電導作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的，這個過程稱為核酸印跡（nucleic acid blotting）轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印跡法（colony and plaque blotting）；然后將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。最后，經(jīng)過放射自顯影技術或光化學、免疫學技術顯示出不同的顏色，根據(jù)顏色的有無和深淺判定結

3、果。根據(jù)操作方式和檢測對象的不同，核酸雜交技術主要有以下幾種：斑點雜交技術（Dot blot）、Southern雜交技術（Southern blot）、Northern雜交技術（Northern blot）。前兩者用于檢測DNA，后者用于檢測RNA。本實驗主要介紹Southern雜交技術。1主要內(nèi)容1. Southern Blot方法的原理。2. DNA瓊脂糖凝膠電泳。3. DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜/尼龍膜及膜處理。4. 介紹隨機引物法標記DNA探針，Southern blot的預雜交、雜交及顯色過程。2目的要求 掌握Southern blot方法的原理；掌握隨機引物法標記DNA探針，印跡法轉(zhuǎn)

4、移DNA至硝酸纖維素膜及膜處理。3 實驗原理Southern雜交技術是由Edward M. Southern在1975年首先發(fā)明的用于檢測DNA的一種核酸雜交技術，并因此而得名。Southern 雜交的原理是將待檢測的DNA分子用限制性內(nèi)切酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按照其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其他標記物標記的DNA探針進行反應。如果待測物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補原理進行結合，游離的探針洗滌后用顯影或其他合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。Southern印跡雜交技術包括兩個主要過程：一是將待測

5、定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程。見圖1。圖 1. Southern blot印跡雜交原理示意圖（a）核酸內(nèi)切酶消化的基因組 DNA； （b）瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段；（c）凝膠中的DNA譜帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上；（d）濾膜與標記的DNA分子探針雜交；（e）顯色顯示雜交的DNA譜帶。Southern blot方法十分靈敏，在理想的條件下，用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即便每條電泳帶僅含2ng DNA也能被清晰地檢測

6、出來。一、 實驗儀器：尼龍膜；恒溫水浴，塑料帶，剪刀，平頭鑷子，封口機，烤箱，臺式高速離心機，高壓滅菌鍋，電泳儀，水平電泳槽，微量移液器，搖床，吸水紙，3MM Whatman濾紙，干烤皿，玻璃平臺等。二、 溶液配制1待檢基因組DNA、DIG標記和檢測試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶等。2其他試劑(1) 20 X SSC(1000 mL) :組分濃度 3.0M的Nacl，0.3M的檸檬酸鈉NaCl 175.32g檸檬酸鈉 88.26g NaOH調(diào)pH值到7.0， (2) 洗滌緩沖液Washing buffer 200ml 組分濃度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5

7、(20); 0.3%(v/v) Tween20. 馬來酸： 2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固體約1.7g調(diào)pH值7.5(3) 馬來酸緩沖液Maleic acid buffer 200ml 組分濃度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20C) 馬來酸： 2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固體約1.7g調(diào)pH值7.5(4) 檢測緩沖液Detection buffer 100ml 組分濃度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20C) Tris 1.21g, N

8、aCl 0.584g MgCl2 1.01g 調(diào)ph值到9.5(5) 變性溶液 (500 mL)：1 mol/L NaCl (43.83 g)，0.5 mol/L NaOH (10 g)，(6) 中和溶液 (500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol/L NaCl (87.66 g)，用1 mol/L HCl調(diào)(7) 5 TBE (250 mL)：13.5g Tris6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL (8) 6 溴酚藍載樣液： 0.25 溴酚藍，40 蔗糖(9) 1M Tris-HCl (pH 8.0): 稱取12.114g

9、Tris-base, 溶于80ml 蒸餾水中， 用HCl 調(diào)pH 至8.0后，用蒸餾水定容至100ml，高壓滅菌，分裝保存。(10) 0.5M EDTA (pH 8.0): 稱取18.61g EDTA，溶于80ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至8.0后，用蒸餾水定容至100ml，高壓滅菌，分裝保存。(11) TE buffer ：取1M Tris-HCl (pH 8.0) 5ml，0.5M EDTA (pH 8.0) 1ml，用蒸餾水定容至500ml，調(diào)pH至8.0后，高壓滅菌，分裝保存。(12) 10% SDS：稱取10g SDS，溶于90ml蒸餾水中，68 加熱溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.2，定

10、容至100ml。(13) 低嚴謹度洗膜液：將20 X的SSC 用蒸餾水稀釋成2 X SSC，并按照100:1( 2 X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成2 XSSC 0.1% SDS。(14) 高嚴謹度洗膜液：將20 X的SSC 用蒸餾水稀釋成0.5 X SSC，并按照100:1(0.5 X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成0.5XSSC 0.1% SDS。(15) Blocking Solution: 用Maleic acid buffer 將6#中的10 X Blocking Solution稀釋成1X的工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。(16) Antibody

11、Solution :將4#試劑離心，按照1:5000加入Blocking Solution，2-8可保存12小時，即每5ml Blocking Solution中加1ul Ab抗體，與地高辛標記探針結合。(17) Color substrate solution (顯色液)：將5#試劑按照1:50 用Detection buffer稀釋，即從5#中取100ul 加入5ml Detection buffer，要避光，現(xiàn)配現(xiàn)用，用于顯示抗體結合位點。(18) 雜交液DiG Easy Hyb：將64ml 無菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶，37 C搖動溶解5min。三、基因組DNA的提取、酶切與電泳

12、分離(1) 酶切反應體系DNA 1g /l 15g10酶切buffer 5 l 限制性內(nèi)切酶（10U/l） 6 l 加ddH2O 至 50l (2) 混勻后于37C酶切1-3h，酶切完成后，取3l酶切反應物電泳分析，檢測酶切效果(3) 酶切完成后，加入EDTA，65加熱滅活限制酶,樣品即可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。四、瓊脂糖凝膠電泳(1) 用0.5 TBE 配制0.8% 的瓊脂糖凝膠，凝膠厚度約為 0.5 cm。(2) 待凝膠充分凝固后，在點樣孔中依次加入：陽性對照：質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，陰性對照：水及檢測樣品。(3) 加入電泳緩沖液至剛好與膠面持平，加1

13、00 V電壓，電泳5 min 待溴酚藍進入膠中后，將電壓降至80 V 電泳30min，(4) 電泳結束后，染色，長波紫外線下觀察電泳結果，用 1 張保鮮膜覆蓋在凝膠上，復制下各分子量參照物及各 DNA 樣品帶的位置，在凝膠旁置 1 標尺照像五、變性與轉(zhuǎn)膜(1) 將膠浸于4倍體積的變性溶液中，在搖床上溫和搖動2 15 min，變性液要能沒過膠。(2) 將膠在雙蒸水中稍微洗滌，然后放入4倍體積的中和溶液中，在搖床上溫和搖動2 15 min，中和液要能沒過膠。(3) 轉(zhuǎn)膜：20SSC浸濕一張whatman 3mm濾紙放在支撐平臺上，此平臺要比凝膠稍大，形成一個“橋”， 凝膠反放在浸濕的whatman

14、 3mm濾紙上注意兩者之間不能有氣泡。(4)照凝膠的大小剪一張硝酸纖維素濾膜/尼龍膜（長，寬略大0.2cm，剪去與凝膠對應的一角）。膜放在凝膠上。(5)尼龍膜上放一張whatman 3mm濾紙（長，寬略小0.2cm）一疊吸水紙、上置一玻璃板，其上放一重約0.20.5kg的物品。在20SCC的轉(zhuǎn)移緩沖液中充分轉(zhuǎn)移1824h及時換掉浸濕的吸水紙。(6) 固定：將膜在2 SSC 溶液中短暫漂洗，除去過多的鹽分，然后DNA 結合面朝上，放在一張干凈的濾紙上晾干后，夾在兩層濾紙中間，120C 烘箱中 30 min，或者80C 2h，促進DNA與硝酸纖維素濾膜/尼龍膜結合。六、預雜交與雜交(1) 預雜交D

15、iG Easy Hyb：將64ml 無菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶，37 C搖動溶解5min，預熱一定體積的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至雜交溫度42C 。預雜交60min，在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中42C下充分潤濕。（此過程可以延長至數(shù)小時）(2) 探針變性：Dig標記的探針1ul（約25ng/ml）加40l H2O, 95 C變性10min后迅速放在冰上冷卻10min。(3) 雜交：將變性的探針加入預熱的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫，倒出預雜交液，加入探針和DIG Easy Hyb混合液，繼續(xù)在42 C下溫浴

16、過夜（單拷貝探針）。含有探針的DiG Easy Hyb雜交液可重復利用，雜交結束后放入離心管中于-20 C保存，可重復使用幾次，只需在使用前于68 C處理10min即可,不要煮沸DiG Easy Hyb雜交液七、洗膜與顯色(1) 洗膜：2SSC，0.1% SDS室溫下洗滌5分鐘，洗2次。0.5SSC，0.1% SDS 65-68C溫和振蕩15分鐘，洗2次(2) 免疫與顯色：a. 雜交和洗膜后，用馬來酸緩沖液（Washing Buffer， Buffer1）浸泡1-5minb. 在100ml 1Block solution（Buffer2）中溫育30minc. 用1Block solution（Buffer2）稀釋抗體DIG-抗原偶聯(lián)物至150mU/ml（1:5000）d. 用10ml antibody solution處理膜30mine. 用100ml馬來酸洗膜15min，洗2次f. 在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5ming. 在8ml 新鮮配制的color substrate solution中處理膜5分