實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time-PCR)實(shí)驗(yàn)流程

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）實(shí)驗(yàn)流程一、RNA的提取(詳見(jiàn)RNA提取及反轉(zhuǎn)錄) 不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因?yàn)镽eal-Time PCR對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實(shí)驗(yàn)前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂；取2ug進(jìn)行RNA的甲醛變性膠電泳檢測(cè)，如果存在DNA污染時(shí)，要用DNase I進(jìn)行消化（因?yàn)樵谔幚磉^(guò)程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑）。二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA 組份 加量

2、模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC處理H2O 至100ul 混勻，37 90min 三、RNA瓊脂糖凝膠電泳11%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制： 1） 稱(chēng)取瓊脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10MOPS緩沖液和39.5ml的DEPC水，放微波爐里溶化。 2） 待冷卻到60攝氏度左右時(shí)，加入1ml甲醛，搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。倒入凝膠板上凝固30min。2取各個(gè)RNA樣品4l，加入6RNA電泳上樣緩沖液2l混勻，加入變性膠加樣孔中。3120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析

3、儀觀察，照相保存。4RNA電泳結(jié)果如下圖所示?？梢?jiàn)28S和18S兩條明亮條帶，無(wú)DNA條帶污染。 四RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA反轉(zhuǎn)錄程序(以MBI的M-MLV為例) 組份 加量(20ul體系) 加量(40ul體系) 模板(RNA) 0.12.5ug(根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)調(diào)整) 3ug(根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)調(diào)整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC處理H2O 至12.5ul 至25ul 混勻，70 5min，立即冰浴 5*buffer 4.0ul 8.0ul dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul RNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul 混勻，3

4、7 5min M-MLV 1.0ul 2.0ul 42 60min ，70 10min 反轉(zhuǎn)錄引物的選擇與Real-Time PCR引物設(shè)計(jì)的要求 1）隨機(jī)六聚體引物： 當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝其全長(zhǎng)序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來(lái)拷貝全長(zhǎng)mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。 2）Oligo(dT)： 是一種僅對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于

5、Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。特別適合檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)，這樣可以節(jié)約反轉(zhuǎn)錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測(cè)稀有基因是否表達(dá)、從極少量細(xì)胞中定量檢測(cè)特定mRNA的表達(dá)水平。 3）特異性引物： 最特異的反轉(zhuǎn)錄方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3端最靠近的配對(duì)引物起始。用此類(lèi)引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。 做 Real Time PCR時(shí)，用于SYBR Green I/Eva Green 法時(shí)

6、的一對(duì)引物與一般PCR的引物，在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求： Tm=55-65 GC=30-80% PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。 引物的退火溫度要高，一般要在 60以上。 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。 至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，

7、你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備-尋找合適的引物非常不易。五、cDNA與引物質(zhì)量檢測(cè) 取0.2ml薄壁PCR管，編號(hào)。向各管中加入含染料2PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物濃度10uM） ，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管補(bǔ)加水至20ul。 組份 加量 2PCRTaqMix 10ul 10uMPrimer FW 0.5ul 10uMPrimer RV 0.5ul Template DNA 1ul ddH2O 混勻至20ul 混勻，置于TP600PCR儀中。95 5min；9515s，6035s ，40cycles；72 5min；4 paus

8、e。 取擴(kuò)增產(chǎn)物各8l，DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)5l/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察。 選擇特異性好，擴(kuò)增效率高的引物作為實(shí)時(shí)熒光使用引物。 六、利用相對(duì)定量的方法分析目的基因表達(dá)量的情況： 由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看家基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達(dá)調(diào)控分析時(shí)至少要做兩個(gè)基因，目的基因和一個(gè)看家基因。 七、定量 PCR檢測(cè)： 取0.

9、2ml薄壁PCR管，分別編號(hào)。向各管中加入2qPCR TaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，對(duì)應(yīng)的cDNA各1ul。一管中不加模板用作陰性對(duì)照。各管補(bǔ)加水至25ul。 組份 加量 模板(cDNA)/ddH2O 1.0ul 10uM 引物F/R 0.5ul 2qPCR Mix 12.5ul ddH2O 11.0ul 混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。955min預(yù)變性后，9515s6535s（熒光檢測(cè)），40cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴(kuò)增設(shè)成一個(gè)溫度，只在擴(kuò)增出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)才會(huì)考慮設(shè)梯度。 八、擴(kuò)增曲線和溶解曲線 溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴(kuò)增。

10、一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期，其形狀是一條平滑的S型曲線。 如果在熒光背景信號(hào)階段出現(xiàn)很多拐點(diǎn)，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì)； 如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。 如果引物二聚體存在則陰性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-Time PCR中很難避免； 若是陰性對(duì)照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說(shuō)明體系配置中存在污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用。在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能： 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個(gè)，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計(jì)引物； 在做基因表達(dá)差異時(shí)容

11、易出現(xiàn)DNA被擴(kuò)增峰（只在引物跨內(nèi)含子時(shí)存在），出現(xiàn)原因是提取RNA時(shí)存在DNA污染，可以通過(guò)電泳驗(yàn)證，這時(shí)要重新消化RNA樣品中的DNA； 擴(kuò)增非特異，這時(shí)要重新摸擴(kuò)增條件或重新設(shè)計(jì)并驗(yàn)證引物。九、表達(dá)差異的計(jì)算方法 絕對(duì)定量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是比較經(jīng)過(guò)處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異之間的表達(dá)差異。 2-CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法。 在有些情況下，并不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量，只需要給出相對(duì)基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說(shuō)X基因在經(jīng)過(guò)某種處理后表達(dá)量增加2.5倍比說(shuō)該基因的表達(dá)從1000

12、 拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。 2-CT方法的推導(dǎo)（詳見(jiàn)實(shí)時(shí)定量PCR和2-CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量） 補(bǔ)充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對(duì)樣品重新進(jìn)行氯仿抽提，具體實(shí)驗(yàn)流程如下： 消化后總體積10Oul，體積太少，不利于抽提，我們往往補(bǔ)加200ulDEPC水。1. 向離心管中加入等體積氯仿（約300ul） ，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。414000 rpm離心8min，取上清（約250ul）。2. 加入1/10體積的NaAC（3M）（約25ul）和預(yù)冷的等體積異丙醇（約280ul），-20放置20min。3. 414000 rpm離心15min，去上清，注意不要觸到沉淀