微生物浸入試驗

1、.類別：技術標準凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗證編碼：部門：生產(chǎn)技術部頁碼：共4頁，第1頁1.目的：1.1.通過微生物侵入試驗確認凍干生產(chǎn)線中壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)是否完好。2.編制依據(jù)：2.1 .藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范2010年版2.2 .中國藥典2010年版二部3.支持性文件：標 題文件編號存放地點4.概述：4.1. 微生物侵入試驗是對容器/密封系統(tǒng)完好性的挑戰(zhàn)性試驗。在驗證試驗中，取西林瓶，裝入培養(yǎng)基，在正常生產(chǎn)線上壓塞、扎蓋。此后，將容器密封面侵入高濃度運動菌液中，取出、培養(yǎng)并檢查是否有微生物侵入，以確認容器密封系統(tǒng)完好性。此同時，需作陽性對照試驗，確認培養(yǎng)基的促菌生長能力。5.范圍：

2、本確認方案適用于本公司凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗證。6.實驗材料大豆胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基（SCDM/2）、銅綠假單胞菌(ATCC 9027) 、革蘭染色、含0.5的過乙酸的70異丙醇、凍干粉針生產(chǎn)線西林瓶、膠塞、鋁蓋、凍干粉針生產(chǎn)線壓塞機及軋蓋機、盛菌懸液的容器、固定西林瓶支架等。7.時間安排年 月 日 年 月 日類別：技術標準凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗證編碼： 部門：生產(chǎn)技術部頁碼：共4頁，第2頁8.試驗步驟8.1.試驗用培養(yǎng)基的制備。8.1.1.在生產(chǎn)線上取足夠量按相應清潔滅菌規(guī)程制備好的西林瓶、灌裝已滅菌的SCDM/2(大豆胰蛋白胨肉湯)培養(yǎng)基，在凍干生產(chǎn)線上抽真空、壓

3、塞及扎蓋將西林瓶密封。8.1.2.將密封良好的西林瓶取出，每一西林瓶倒轉，使培養(yǎng)基與容器內(nèi)表面充分接觸，并小心去除至少50個試樣的鋁蓋，注意不要破壞其密封口（將去鋁蓋時不慎損壞容器密封性的所有試樣剔除），在3035下豎放培養(yǎng)14天。8.1.3.接受標準：在培養(yǎng)期內(nèi)，各試樣不生長菌。8.2.確認培養(yǎng)基促菌生長能力-營養(yǎng)性試驗8.2.1.所有試樣培養(yǎng)14天均不長菌時，隨機取出20個帶蓋試樣，每個試樣內(nèi)接種0.1ml的銅綠假單胞菌ATCC 9027，菌液濃度：10100CFU/0.1ML8.2.2.在3035下培養(yǎng)7天，或培養(yǎng)至所有試樣都呈陽性結果。8.2.3.若7天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣中

4、，微生物生長良好，則容器內(nèi)培養(yǎng)基的促菌生長能力合格。8.2.4.可是使用革蘭染色和紫外燈下肉湯呈藍綠色熒光的性質，來鑒定并確認試樣容器內(nèi)生長的菌為接入的銅綠假單胞菌。8.3.挑戰(zhàn)菌懸浮液的制備8.3.1.從銅綠假單胞菌ATCC 9027的新鮮斜面上取一整環(huán)培養(yǎng)物，分別接入含6ml無菌培養(yǎng)基的試管中，在3035下培養(yǎng)1618小時。8.3.2.將每管的培養(yǎng)物分別轉入含600ml相同培養(yǎng)基（SCDM/2）的容器內(nèi)，于3035下培養(yǎng)2224小時。在培養(yǎng)結束時，能明顯見容器內(nèi)培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁。8.3.3.在挑戰(zhàn)試驗開始時，挑戰(zhàn)用菌懸液濃度（活菌數(shù)）必須達到：1*106CFU/ml。8.3.4培養(yǎng)結束后的菌

5、懸液即可用來作壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)系統(tǒng)完好性試驗。8.4.微生物侵入試驗本試驗需在生物安全柜內(nèi)或其他不影響生產(chǎn)環(huán)境的地方進行。類別：技術標準凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗證編碼：部門：生產(chǎn)技術部頁碼：共4頁，第3頁8.4.1.將新鮮的銅綠假單胞菌ATCC 9027菌懸液倒入合適的盆中，用金屬支架固定試樣容器，使試樣倒置在菌懸液中。8.4.2.將50個經(jīng)過凍干線的抽真空、壓塞、扎蓋的西林瓶的試樣倒置入菌懸液中，該組試樣記為A組。同時，將25個去除鋁蓋的試樣容器倒置入菌懸液中，該組試樣記為B組。（試樣容器內(nèi)的無菌培養(yǎng)基應充分接觸封口內(nèi)表面，樣品的頸部及封口的外表面應完全浸泡在懸液中）。8.4.

6、3. 實驗開始時取一份菌懸液，平板計數(shù)每毫升所含的活菌數(shù)，并通過革蘭染色方法確認微生物是銅綠假單胞菌。8.4.4.將A組及B組試樣容器在菌懸液中持續(xù)浸泡約4小時。8.4.5.浸泡結束時，利用平板計數(shù)法計數(shù)菌懸液的濃度。從菌懸液中取出試樣，擦干試樣容器外的殘余菌懸液，然后用含0.5的過乙酸的70異丙醇消毒容器外表面。8.4.6.取裝滿培養(yǎng)基的有鋁蓋和去鋁蓋的樣品各兩個，作為陽性對照。陽性對照試樣不經(jīng)過菌懸液的浸泡，其外表用含0.5的過乙酸的70異丙醇消毒，后接入10100CFU銅綠假單胞菌ATCC 9027。8.4.7.將消毒后所有的試樣放在塑料袋中，在3035下培養(yǎng)7天。在操作過程中不要損壞無

7、鋁蓋試樣膠塞的密封性。8.4.8.培養(yǎng)7天后，對每一試樣進行觀察檢查，有微生物生長記作“+”，無微生物生長記作 “”。將結果記錄在凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性試驗結果記錄。.;.類別：技術標準凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗證編碼： 部門：生產(chǎn)技術部頁碼：共4頁，第4頁8.4.9.如果容器中長菌，利用革蘭氏染色法鑒定所長菌為銅綠假單胞菌；如果容器中不長菌，則從浸過菌懸液的A組取10個試樣，B組取5個試樣，分別進行微生物營養(yǎng)性試驗。注1：在實驗的過程中所有的營養(yǎng)試驗必須都合格，這樣試樣的挑戰(zhàn)試驗才有效果。注2：挑戰(zhàn)試驗所用菌懸液需經(jīng)過滅菌后丟棄。注3：在培養(yǎng)期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)任何帶蓋試樣長菌時

8、，則試驗無效，須棄去全部試樣，重新從頭開始。9.接收標準9.1.微生物營養(yǎng)性試驗9.1.1.若7天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣品中，微生物生長良好，則容器內(nèi)培養(yǎng)基的促菌生長能力可判為合格。使用革蘭氏染色鏡檢，并置于紫外燈下，培養(yǎng)基呈藍綠色熒光，則確定試樣品容器內(nèi)生長的菌為所接入的銅綠假單胞菌，即為陽性。9.1.2.若7天內(nèi)，所接種的銅綠假單胞菌的試樣品中，微生物生長不良好或鑒別后受其他的污染，則試驗失敗，需重新做營養(yǎng)性試驗。9.2.微生物侵入試驗9.2.1挑戰(zhàn)試驗中A組和B組如果長菌，需記錄長菌的試樣數(shù) ，在A組中如出現(xiàn)長菌試樣則需經(jīng)過以下要求進一步調查。9.2.2.仔細去除微生物生長的容器的蓋和塞，檢查容器封口是否有缺損，造成微生物入侵，將檢查到試樣容器口缺損的應當詳細的記錄。9.2.3. 如果任何挑戰(zhàn)試驗中長菌的容器不是由于容器封口明顯的物理性缺損所致，則說明容器/密封系統(tǒng)挑戰(zhàn)試驗失敗。.;表1：微生物營養(yǎng)性試驗檢測記錄接種日期接種人接入菌種培養(yǎng)天數(shù)檢查觀察結果檢查人復核人表2：凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性試驗結果記錄加塞扎蓋時間營養(yǎng)性試驗結論試樣浸泡時間試樣培養(yǎng)時間浸