膜片鉗常見問題解答

1、膜片鉗常見問題解答（一）1.什么是電壓鉗與膜片鉗，有什么區(qū)別？答：電壓鉗技術(shù)是通過向細胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開放時所產(chǎn)生的離子流，從而將細胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映離子流的大小和方向。膜片鉗技術(shù)鉗制的是“膜片”，是指采用尖端經(jīng)過處理的微電極與細胞膜發(fā)生緊密接觸，使尖端下的這片細胞膜在電學(xué)上與其它細胞膜分離，這大大降低了背景噪聲，使單通道微弱的電流得以分辨出來。采用電壓鉗技術(shù)將這片膜的電位鉗制在某一數(shù)值，可記錄到單通道電流。從這點上看，膜片鉗技術(shù)是特殊的電壓鉗技術(shù)。隨著膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，它已經(jīng)不僅僅局限于“膜片”的概念，也不僅

2、僅采用電壓鉗技術(shù)，還常采用電流鉗技術(shù)。2. 離子通道電導(dǎo)的單位是什么？如何換算？答：離子通道電導(dǎo)的單位是西門子（Siemens, S），舊稱姆歐，即安培/伏特。常用皮西門子（pS），1pS10E-12 S，1,000 pS1 pA/mV。3. MultiClamp 700A中，在放大器和信號器的連接中，放大器的raw output是否需要連接信號器的 ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么區(qū)別?答：Raw output為原始信號輸出，放大器輸出的信號沒有經(jīng)過處理（如濾波、放大等），scaled output為定標(biāo)輸出，輸出的信號經(jīng)過了處理。后者的靈活

3、度大，因此多采用。目前膜片鉗放大器多設(shè)有scaled output，你可將其與數(shù)模轉(zhuǎn)換器（你所說的信號器）的ANALOG IN連接，這樣放大器的輸出信號就能傳送給計算機了，此時已經(jīng)沒有必要再使用Raw output了。若你想記錄兩個輸出，則需要將Raw output與數(shù)模轉(zhuǎn)換器的另一個ANALOG IN連接。4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么適用范圍？答：Ramp多用于電流衰減緩慢的離子通道以及失敏不明顯的受體通道的I-V曲線制作，如多用于鉀、鈣離子通道。而像鈉通道，其衰減非常迅速，在持續(xù)去極化的情況下，通道很快失活，無法使用ramp，另

4、外諸如煙堿受體通道等具有明顯失敏特征的受體通道也不宜采用ramp。5. 什么是ramp？有什么作用？答：與步階（step）不同，ramp在pClamp軟件中表示施加給細胞的一種逐漸變化的電壓或電流，稱為“斜坡電壓或電流”，可用于作通道I-V曲線。膜片鉗常見問題解答（二）6. input resistance是什么意思？如何測量？答：在電生理學(xué)中，“input resistance”指“輸入膜電阻（Rin）”。全細胞記錄時，給細胞膜施加一系列刺激方波（一般為超極化），在離子通道沒有開放的情況下測定跨膜電流，根據(jù)歐姆定律即可求出Rin。膜電阻（Rm）與膜輸入阻抗Rin的關(guān)系為：Rm4r2 Rin，

5、r為細胞半徑。7. 在一次電壓鉗全細胞記錄中，是否每次一定要做電容消除、串連電阻補償、漏減、和液接電位矯正？答：在電壓鉗實驗中，如果需要給予細胞電刺激來改變細胞膜電位（如超極化或去極化），則會出現(xiàn)膜的被動反應(yīng)，產(chǎn)生電容電流與電阻電流，此時，前者需要用電容補償消除，后者需要用漏減功能消除。全細胞記錄中，串聯(lián)電阻是必須要補償?shù)模ㄖ辽僖a償80%），除非它很小而忽略不計。液接電位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可采用Clampex軟件中的菜單Tools/ Junction Potential功能對其測算，然后決定是否需要校正。8. Decay是什么意思？和inactivation有何

6、區(qū)別?答：Decay是“衰減”之意，inactivation是“失活”之意，但在文獻中經(jīng)常混用，decay也常常被說成失活，例如鈣電流的衰減常被說成失活，這樣用也沒什么問題。但實際上，兩者細分的話還是有區(qū)別的。可以將Inactivation分為穩(wěn)態(tài)失活與非穩(wěn)態(tài)失活。后者即Decay，是指在刺激因素（電位變化、施加藥物等）持續(xù)存在下通道的失活，而穩(wěn)態(tài)失活（Steady-state inactivation）一般是指將膜電位鉗制在不同的水平，然后觀察通道的失活情況，做出失活曲線。9. 什么是尾電流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？答：在離子通道的激活因素（去極化或超級化）結(jié)束時通道的關(guān)閉過

7、程叫做去激活(Deactivation)，所記錄到的電流稱為尾電流（Tail current），主要反映通道的關(guān)閉特征。延遲整流性K+離子通道以及一些不同類型的Ca2+離子通道，它們的尾電流均具有電壓依賴性，關(guān)閉過程呈指數(shù)分布，可用指數(shù)方程擬合而獲得通道關(guān)閉過程的時間常數(shù)。尾電流的分析對研究電壓門控性離子通道的激活、關(guān)閉、失活等動力學(xué)過程很有幫助。如研究尾電流幅度與脈沖電壓的關(guān)系、脈沖電壓的不同持續(xù)時間或尾電流不同的鉗制電壓對尾電流幅度、衰減時間常數(shù)的影響等等。通過這些研究可了解通道關(guān)閉過程中出現(xiàn)的不同關(guān)閉狀態(tài)。藥物可影響通道的關(guān)閉過程，表現(xiàn)為尾電流的衰減過程變快或變緩慢。10. 如何理解st

8、eady state activation中的steady state 的意義？答：“steady state”是“穩(wěn)態(tài)”的意思。一般通過給予細胞持續(xù)一定時間的一系列去極化（多為去極化）脈沖來激活離子通道，記錄通道電流峰值，再計算岀電導(dǎo)G，作出G-V曲線，該曲線稱為穩(wěn)態(tài)激活曲線，也就是我們常說的激活曲線。膜片鉗常見問題解答（三）11. 電極拉制程序中具體應(yīng)該如何控制。在參數(shù)設(shè)定的摸索中，是否需要每次都用顯微鏡檢測，還是另有更易操作的方法.答：不同的拉制儀拉制參數(shù)的設(shè)置不盡相同，你需要閱讀說明書，參數(shù)中主要是設(shè)定拉力（對于P-97拉制儀，只需要設(shè)置Velocity，可不用設(shè)定Pull）與溫度。一

9、般第一步拉制電極頸部，溫度要比第二步高（對于P-97拉制儀，溫度的設(shè)定需要先測量Ramp值），拉力不要過大，以保證頸部較短；第二步拉制尖端，一般要使溫度低些，拉力大些。一般都是通過顯微鏡查看電極尖端，這很簡單，并不復(fù)雜！最好是拋光，這樣就在拋光儀顯微鏡下查看。注意拋光后的電極尖端開口會變小，故在拉制電極時，尖端開口要大些。檢查電極還有其它方法，如“氣泡數(shù)法”，也可用放大器通過測量電阻來查看。12. Rm4r2Rin？似乎Rin是一個用細胞大小標(biāo)化的膜電阻，那為什么不用電容Cm來標(biāo)化而用這個什么4r2？細胞形狀各異，Cm是個公認的膜面積的指標(biāo)，電流密度不就是用Cm標(biāo)化的嗎？盼回答，同時希望能將R

10、in的意義再多講一點，謝謝答：（1）一定要注意不要拘泥于Rm和Rin這兩個符號，文獻中?；煊?，但實際上表示的大多是Rin。通常我們所說的“膜電阻”是指“膜輸入阻抗Rin”，但也有人用來指Rm。（2）你可以用Cm來計算膜面積，實際上這也正是我們的做法，用來估算細胞大小，用于對通道電流幅度進行標(biāo)化，但我們從來不用它計算膜電阻Rm（也稱為“固有膜電阻”）。Rm的計算公式是數(shù)學(xué)理論上的，并沒有多少應(yīng)用的價值，我們很少發(fā)現(xiàn)有使用Rm的（雖然符號用Rm）。（3）實際上，Rin反映的當(dāng)然就是膜電阻，它被稱為膜輸入阻抗（或膜輸入電阻），也時常被稱為“膜電阻”（這正是使人們產(chǎn)生混淆的原因?。悄さ谋粍臃磻?yīng)參數(shù)

11、之一。所謂被動反應(yīng)是指膜上離子通道沒有開放時，膜所表現(xiàn)出的電纜特性。膜的被動反應(yīng)參數(shù)還包括膜電容、軸漿電阻等。全細胞記錄時，給細胞膜施加一系列刺激方波（多為超極化），在離子通道沒有開放的情況下測定跨膜電流，根據(jù)歐姆定律可求出Rin。當(dāng)大量離子通道開放時，膜對電流的阻力急劇降低，測試脈沖電壓與通道電流之間不滿足歐姆定律，無法測量Rin，也沒有了測量的意義。13. 請教什么是Channel availability？答：Channel availability指在排除失活情況下，能夠開放的某通道的多少，通過全細胞電流幅度的大小來反映。例如，海馬神經(jīng)元Na通道的channel availabilit

12、y可因乙酰膽堿M受體的激活而降低，表現(xiàn)為Na通道電流幅度的降低。14. 什么是window current，我知道是激活曲線和失活曲線的重疊。但是我有一個疑問，比如電壓依賴的T型鈣通道，書上說在windonw current的時候有持續(xù)性的鈣內(nèi)流，但是T性鈣通道不是有時間依賴性的失活嗎？怎么會有不失活的電流呢？答：如果將通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線與失活曲線作在一個圖上，則激活曲線與失活曲線之間交叉部分的電流就是window current，在這個電壓范圍內(nèi)，有一些通道并沒有完全失活，仍能被打開，有一定的開放概率。T性鈣通道是有時間依賴性的失活，但還有很小的部分失活非常緩慢，此即window curre

13、nt，它是一些快速失活通道的動力學(xué)特征。對于T型鈣通道，其window current維持了一個緊張性去極化，對動作電位的連續(xù)發(fā)放產(chǎn)生影響，當(dāng)然，不同細胞中的T通道其作用不盡相同。15. 使用Clampex 8.0記錄配體門控離子通道電流，protocol 如何設(shè)置?答：需要事先在Lab Bench中設(shè)定好Channel序號和Signal名稱。在Edit Protocol中選擇Gap-free模式，采樣頻率可用5kHz，選好Input和Output。先在Clampex中啟動記錄（Record），然后誘發(fā)電流，可用Time Tag作誘發(fā)標(biāo)記。膜片鉗常見問題解答（四）16. 電極內(nèi)液中加入1mmo

14、l/L的EGTA和10mmol/L的EGTA有什么區(qū)別?答：EGTA一般用10 mM左右（1 mM太低），促進封接，鰲和內(nèi)鈣。17. 什么是漏電流，為什么要做Leak subtraction？答：漏電流的概念比較混亂，可以指封接電流（封接時從封接處“漏掉”的電流），也可指放大器的系統(tǒng)偏差，還可指膜漏電流。一般來講，膜漏電流是細胞膜的被動反應(yīng)電流，是非離子通道電流，因此在記錄離子通道電流時要將它去除。膜片鉗放大器與采樣分析軟件都具有將其去除的漏減功能。18. 請問動作電位是否一定要有越過0的超射，我在一篇文獻中看到作者將一個沒有超射的電位變化也稱為動作電位，我覺得不對，應(yīng)該是閾下反應(yīng)才對吧？但又

15、不敢下結(jié)論，覺得國外文獻不該出錯。答：一般生理情況下動作電位都含有超射，超射與Na離子（或Ca離子）的平衡電位有關(guān)。但在具體實驗中（或某些病理情況下），若細胞內(nèi)外液的Na離子（或Ca離子）的濃度發(fā)生變化，則Na離子（或Ca離子）的平衡電位也隨之變化，就可能不產(chǎn)生超射或超射值更大。19. 我想請教一下為什么我們用培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元記錄NMDA電流，總是會出現(xiàn)電流的衰減，而且我們記錄是選擇的培養(yǎng)第10-14天的大鼠，可是電流大小不等，具體在100-1500pA間波動，這讓我們很疑惑，注明一下，電極內(nèi)液中我們用了CsCl和ATP、GTP。答：電流大小不等與細胞大小、細胞狀態(tài)等都有關(guān)，另外更重要的可

16、能與你的給藥方法有關(guān)，不知你采用的是哪種給藥方法？正常情況下，連續(xù)誘發(fā)受體電流會存在失敏，表現(xiàn)為電流的衰減（幅度減?。?，但如果在記錄過程中細胞狀態(tài)逐漸不好，也會出現(xiàn)這種情況。我們認為你所選用的細胞培齡沒有問題，內(nèi)液也沒問題。20. 腦片實驗中，ACSF的配方中的Mg離子，有的用的MgSO4，有的用的MgCl2，他們有什么區(qū)別？有關(guān)滲透壓，有的配方是295 mOsm，有的300多mOsm，他們又有什么區(qū)別？如何調(diào)整ACSF的滲透壓？答：用MgSO4和用MgCl2沒多大區(qū)別，但如果要記錄Cl電流，就要有所考慮；另外若所需要的Mg濃度有大的變化，也要考慮到Cl和SO4離子所可能帶來的問題。滲透壓有個

17、范圍，一般在290320之間都沒有問題，精確地測量與調(diào)節(jié)滲透壓需要特殊的滲透壓儀，但一般都是通過離子強度進行計算，只要大體在上述范圍就行。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（1）1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片鉗技術(shù)（Patch clamp technique），這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜上單一的或多數(shù)的離子通道分子活動的技術(shù)。1981 年Hamill, Neher 等人又對膜片鉗實驗方法和電子線路進行了改進，形成了當(dāng)今廣泛應(yīng)用的膜片鉗實驗技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于許多細胞系的研究，也是目前唯一可記錄一個蛋白分子電活動的方法，膜片鉗技術(shù)和克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)給生命科

18、學(xué)研究帶來了巨大的前進動力，這一偉大的貢獻，使Neher 和Sakmann 獲得1991 年諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎。一 膜片鉗技術(shù)的基本原理用一個尖端直徑在1.53.0m 的玻璃微電極接觸細胞膜表面，通過負壓吸引使電極尖端與細胞膜之間形成千兆歐姆以上的阻抗封接，此時電極尖端下的細胞膜小區(qū)域（膜片，patch）與其周圍在電學(xué)上分隔，在此基礎(chǔ)上固定（鉗制，Clamp）電位，對此膜片上的離子通道的離子電流進行監(jiān)測及記錄?；镜膬x器設(shè)備有膜片鉗放大器、計算機、倒置顯微鏡、示波器、雙步電極拉制器、三軸液壓顯微操縱器、屏蔽防震實驗臺、恒溫標(biāo)本灌流槽、玻璃微電極研磨器。膜片鉗放大器是離子單通道測定和全細胞記錄

19、的關(guān)鍵設(shè)備，具有高靈敏度、高增益、低噪音及高輸入阻抗。膜片鉗放大器是通過單根電極對細胞或膜片進行鉗制的同時記錄離子流經(jīng)通道所產(chǎn)生的電流。膜片鉗放大器的核心部分是以運算放大器和反饋電阻構(gòu)成的電流-電壓（I-V）轉(zhuǎn)換器，運算放大器作為電壓控制器自動控制，使鉗制電位穩(wěn)定在一定的水平上。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（2）二 操作步驟 膜片鉗微電極制作(1) 玻璃毛細管的選擇：有二種玻璃類型，一是軟質(zhì)的蘇打玻璃，另一是硬質(zhì)的硼硅酸鹽玻璃。軟質(zhì)玻璃在拉制和拋光成彈頭形尖端時錐度陡直，可降低電極的串聯(lián)電阻，對膜片鉗的全細胞記錄模式很有利；硬質(zhì)玻璃的噪聲低，在單通道記錄時多選用。玻璃毛細管的直徑應(yīng)符合電極支

20、架的規(guī)格，一般外部直徑在1.11.2mm。內(nèi)徑1mm。(2) 電極的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中間拉長成一窄細狀，第二次拉制窄細部位斷成二根，其尖端直徑一般在15m，充入電極內(nèi)液后電極電阻在15M為宜。調(diào)節(jié)第一步和第二步拉制時加熱線圈的電流強度，即可得到所需要的電極尖端直徑。電極必須保持干凈，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)拉制。(3) 涂硅酮樹酯：記錄單通道電流時，為了克服熱噪聲、封接阻抗噪聲及電極浸入溶液產(chǎn)生的浮游電容性噪聲，需要在電極尖頸部（距離微電極尖端50mm）的表面薄薄地涂一層硅酮樹酯（sylgard），它具有疏水性、與玻璃交融密切、非導(dǎo)電性的特性。涂完硅酮樹酯的玻璃微電極須通過加熱的鎳鉻電阻線圈

21、烘干變固，以防硅酮樹酯順著電極流向尖端而影響千兆封接。烘干后才能進行熱磨光。(4) 熱磨光(heat polish)：一般在玻璃研磨器下對電極尖端進行熱磨光，磨光后可使電極尖平滑并燒去過多的硅酮樹酯薄膜，有利于千兆封接的形成。目前大多數(shù)實驗室在作全細胞模式記錄時，不涂硅酮樹酯也不進行熱磨光，也可形成很好的千兆封接。(5) 電極液的充灌：目前最常應(yīng)用的是用注射器反向充灌。用細長的注射器針頭或拉細的聚乙烯膠管從電極尾端插入到電極尖端，再進行灌注。灌注后電極尖端有少許氣泡，排除氣泡的方法是用左手拿住電極，尖端向下，用右手輕輕彈擊電極，可見氣泡徐徐上升直至排除。電極液不要充灌太滿，能與探頭的銀絲接觸上

22、即可，溶液過多會浸入探頭支持架致使潮濕而影響實驗記錄。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（3） 溶液的組成(1) 電極液：根據(jù)記錄的電流不同電極液的成分也不同。基本要求是等張的KCI 溶液，Ca2+ 濃度為10100nmol (pCa 78)，pH 值77.4。這里介紹一個在全細胞記錄模式時，通過改變保持電位，能分別記錄到Na+、K+、Ca2+ 電流的電極液成分(mmol/L)：K Aspartic 49.89，KCI 30.37， KH2PO4 25，HEPES 20.12，EGTA 0.999，KOH 29.95，MgCI2 1，CaCI2 0.2，ATPNa2 6.8。用KOH 調(diào)pH 至7

23、.4。如果要記錄純的Na+、K+、Ca2+ 電流，則需要使用相應(yīng)的工具藥。HEPES（N-2-hydroxyethyopiperazine-N-2-ethanesulfonic acid，羥乙基哌嗪乙烷磺酸）(2) 細胞外液（浴槽液）：分離細胞和記錄電流時應(yīng)用。分離神經(jīng)細胞主要用人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid solution，ACSF），成分（mmol/L）：NaCI 124，KCI 2.5，NaH2PO4 1.25，MgSO4 2.0，CaCI2 2，NaHCO3 26，glucose 10。該液體需要通以95%O25%CO2 混合氣體。如果用HE

24、PES 作緩沖系，則ACSF 的成分如下（mmol/L）：NaCI 140，KCI 2.5，MgCI2 1，CaCI2 1，glucose 25，HEPES 10。上述溶液的配制均使用去離子水。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（4） 神經(jīng)細胞的分離運用膜片鉗技術(shù)進行電生理學(xué)研究需要制備合適的單個細胞作標(biāo)本，細胞制備的好壞直接影響實驗的成功率。膜片鉗實驗要求細胞標(biāo)本具有呼吸活性、耐鈣、細胞膜完整、平滑、清潔度高的條件，以利于微電極與細胞膜進行高阻封接?；钚院玫募毎谛纬扇毎Ｊ胶罂梢员３只钚院荛L時間，足以保證實驗的順利進行。因此制備好的細胞標(biāo)本是膜片鉗實驗的關(guān)鍵第一步。七十年代以來，出現(xiàn)了許多分

25、離各類細胞的分離技術(shù)，但是進行電生理學(xué)研究尤其是膜片鉗實驗多應(yīng)用酶解分離細胞的方法。我們實驗室曾分離過豚鼠心室肌細胞、大鼠肝臟細胞、大鼠腦皮層神經(jīng)細胞、家兔肺動脈平滑肌細胞和人腦皮層神經(jīng)細胞及人心房肌細胞。這里重點介紹大鼠腦皮層神經(jīng)細胞的分離技術(shù)。(1) 用30mg/kg 戊巴比妥鈉ip 麻醉后，斷頭開顱取出大腦半球放入冷的人工腦脊液中，輕輕剝離腦膜和血管等纖維組織，然后取腦皮層在人工腦脊液中剪成2mm2mm 的組織塊靜止小時，并通以氧氣。(2) 將腦組織塊放入含有protease 16unit/ml ( type , sigma )和protease 2unit/ml (type , sig

26、ma)的人工腦脊液中，在36恒溫震蕩(60 次/min)水浴中孵育60 分鐘左右。(3) 將組織塊取出，反復(fù)用人工腦脊液沖洗次，以徹底清除消化酶，于室溫下靜止60 分鐘并繼續(xù)通氧，實驗前將組織塊輕柔吹打后即可分離出單一的神經(jīng)細胞供實驗使用。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（5） 千兆歐姆封接取一滴細胞液，滴入浴槽中，用人工腦脊液進行灌流，將浮游的死細胞沖走，待細胞貼壁后即可進行封接吸引。通過PCLAMP 軟件或電子刺激器，給予一個20mV，1050ms的矩形波刺激，當(dāng)電極進入浴槽溶液時，記錄電流的直線變成與矩形波電壓脈沖相對應(yīng)的矩形波曲線，將電極尖輕輕壓在細胞膜表面，此時電流曲線的高度變低，給電

27、極以負壓吸引，由于電極尖與細胞膜逐漸密接，細胞膜與電極間的電阻逐漸增加，電流曲線逐漸減小直至變成一條直線，則形成了千兆歐姆封接。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（6）5記錄模式根據(jù)研究目的選擇記錄模式，主要有下面敘述的前種，后種是依據(jù)前種變更而來的。(1) 細胞貼附式 (cell-attached 或on-cell mode)：千兆歐姆封接后的狀態(tài)即為細胞貼附式模式，是在細胞內(nèi)成分保持不變的情況下研究離子通道的活動，進行單通道電流記錄。即使改變細胞外液對電極膜片也沒有影響。(2) 膜內(nèi)面向外式 (inside-out mode)：在細胞貼附式狀態(tài)下將電極向上提，電極尖端的膜片被撕下與細胞分離，形

28、成細胞膜內(nèi)面向外模式。此時膜片內(nèi)面直接接觸浴槽液，灌流液成分的改變則相當(dāng)于細胞內(nèi)液的改變?？蛇M行單通道電流記錄。此模式下細胞質(zhì)容易滲漏(washout)，影響通道電流的變化，如Ca2+ 通道的run-down 現(xiàn)象。(3) 全細胞式 (whole-cell mode) 記錄： 在細胞貼附式狀態(tài)下增加負壓吸引或者給予電壓脈沖刺激 (zapping)，使電極尖端膜片在管口內(nèi)破裂，即形成全細胞記錄模式。此時電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液相通成為和細胞內(nèi)電極記錄同樣的狀態(tài)，不僅能記錄一個整體細胞產(chǎn)生的電活動，并且通過電極進行膜電位固定，也可記錄到全細胞膜離子電流。這種方式可研究直徑小于20m 以下的小細胞的電活動

29、；也可在電流鉗制 (current clamp)下測定細胞內(nèi)電位。目前將這種方法形成的全細胞式記錄稱作常規(guī)全細胞模式 (conventional whole-cellmode 或hole cell mode)。(4) 膜外面向外式 (outside-out mode)：在全細胞模式狀態(tài)下將電極向上提，使電極尖端的膜片與細胞分離后又粘合在一起，此時膜內(nèi)面對電極內(nèi)液，膜外接觸的是灌流液?？稍诟淖兗毎庖旱那闆r下記錄單通道電流。(5) 開放細胞貼附膜內(nèi)面向外式 (open cell-attached inside-out mode)：在細胞貼附式狀態(tài)下，用機械方法將電極膜片以外的細胞膜破壞，從這個破

30、壞孔調(diào)控細胞內(nèi)液并在細胞貼附式狀態(tài)下進行單通道電流記錄。用這種方法時，細胞越大，破壞孔越小，距電極膜片越遠，細胞因子的流出越慢。穿孔膜片式 (perforated patch mode) 或緩慢全細胞式 (slow whole-cell mode)：在全細胞式記錄時由于電極液與細胞內(nèi)液相通，胞內(nèi)可動小分子能從細胞內(nèi)滲漏到電極液中。為克服此缺點，可在膜片電極內(nèi)注入制霉菌素 (nystatin) 或二性霉素 (amphotericin使電極膜片形成多數(shù)導(dǎo)電性小孔，進行全細胞膜電流記錄，故被稱為穿孔膜片式或制霉菌素膜片式 (nystatin-patch mode)。又因胞質(zhì)滲漏極慢，局部串聯(lián)阻抗較常

31、規(guī)全細胞記錄模式高，鉗制速度慢，故也稱為緩慢全細胞式。(7) 穿孔囊泡膜外面向外式 (perforated vesicle outside-out mode)：在穿孔膜片式基礎(chǔ)上，將電極向上提，使電極尖端的膜片與細胞分離后又粘合在一起形成一個膜囊泡。如果條件很好，在囊泡內(nèi)可保留細胞質(zhì)和線粒體等，能在比較接近正常的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝的條件下進行單通道記錄。6. 細胞內(nèi)灌流方法：細胞內(nèi)灌流是在全細胞式狀態(tài)下利用電極內(nèi)灌流法形成的。電極內(nèi)灌流法的裝置是由電極固定部、灌流液槽、注入管、流出管、電極記錄用瓊脂橋所組成。注入管是用直徑2.5 mm 的塑料管經(jīng)加熱拉細制成，使其尖端能插到接近電極的尖頂部。

32、灌流液槽注滿實驗用溶液，插入注入管，當(dāng)千兆封接形成后，由于負壓吸引的作用電極內(nèi)液從流出管流入排液槽的同時，實驗用溶液由流入管注入到電極內(nèi)，電極充滿實驗用溶液后關(guān)閉注入管，完成了液體的交換。這種方法應(yīng)用在“內(nèi)面向外式”時，可同時改變細胞內(nèi)液和細胞外液的組成；應(yīng)用在“全細胞式”時就形成了細胞內(nèi)灌流方法，直接改變了細胞內(nèi)液。膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)藥理方面的應(yīng)用（7）7. 全細胞記錄模式離子通道電流記錄(1) 鈉通道電流 (INa)： 灌流液即細胞外液同人工腦脊液液，也可加入CoCl2 3 mmol/L或nifidipine 10mol/L 以阻斷鈣電流。電極液成分(mmol/L)：CsCl 150, EG

33、TA 11, CaCl2 1,MgCl2 1, HEPES 10, 用CsOH 調(diào)pH 至7.4。電壓鉗制方案，通常設(shè)保持電位 (holding potential) 為-80 mV，去極化電壓為 -10+40mV，步階電壓10 mV，去極化的保持時間（刺激脈沖寬度或鉗制時間）1040 ms。當(dāng)全細胞記錄方式形成后，利用上述電壓鉗制方案，即可記錄出INa。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)制作電流-電壓 (current-voltage, I-V) 關(guān)系曲線，從中找到Na+ 電流的激活電位、反轉(zhuǎn)電位和最大電流的電壓區(qū)域。(2) 鈣通道電流 (ICa)：灌流液有兩種方案，一是人工腦脊液中加入TTX 10mol/L，另

34、一是將人工腦脊液中的NaCl 換成N-methyl-D-glucamine 130mol/L, pH 用CsOH 調(diào)至7.4。電極液的組成(mmol/L)：Aspartic acid 60, CsOH 60, MgCl2 4, HEPES 10, EGTA 10, Na2ATP 3。用CsOH 調(diào)pH 至7.4。通常使用的電壓鉗制方案是設(shè)保持電位為-40 mV，去極化電壓為10110 mV，步階電壓10 mV, 鉗制時間300 ms，此方案記錄的是L 型Ca2+ 通道電流；但在此保持電位下記錄到的Ca2+ 電流尚含有Na+ 通道電流或尚有T 型Ca2+ 通道電流。記錄由于沒有特異的T 型Ca2

35、+ 通道阻滯劑，若想獲得較純凈的L 型Ca2+ 通道電流，將保持電位抬高到-30 mV 即可。記錄T 型Ca2+ 通道電流的電壓鉗制方案是設(shè)保持電位為-80 mV，仍以10 mV 的步階電壓去極，去極化電壓為10170 mV，應(yīng)用L 型Ca2+ 通道阻滯劑，如：nitrendipine、nisodipine、nifedipine 等，即可得到較純凈的T 型Ca2+ 通道電流。兩種方案得出的膜電流峰值，均可繪制I-V 曲線。(3) 鉀通道電流：神經(jīng)細胞上亦存在多種K+ 通道，其研究也很復(fù)雜，通常最直觀最容易觀察和記錄得到的K+ 通道電流不外乎幾種。這里僅就延遲整流通道、內(nèi)向整流通道及瞬間外向電流

36、通道的電流記錄加以介紹?；疽后w 灌流液的組成 (mmol/L)： N-methyl-D-glucamine 135, KCl 5.4, CaCl 1.8,MgCl2 0.5, HEPES 10, Glucose 5.5。用HCl 調(diào)pH 至7.4。也可在灌流液中加入TTX(10-6mol/L)和Cd+ (0.20.5mmol/L)，以阻斷Na+ 和Ca2+ 通道。電極溶液為通常的細胞內(nèi)液。 延遲外向整流電流 (delayed rectifier outward current, Ikr)：設(shè)保持電位為 80 mV，去極化電壓為 -20+170 mV，步階電壓10 mV, 鉗制時間可這在100

37、400 ms，時間間隔為23ms 以上。有時可將保持電位設(shè)在 30 mV 或 40 mV，這樣不僅可以使T 型Ca2+ 通道失活，記錄出Ikr，而且也可以同時記錄到尾電流 (Itail)，尾電流也是延遲外向整流電流的一種表現(xiàn)形式，當(dāng)鉗制方波從 +70 mV 或 +90 mV 復(fù)極到保持電位時，這個電流并不緊隨，而是延遲于復(fù)極的鉗制方波，以指數(shù)衰減方式，逐漸回至電流基線?，F(xiàn)認為Itail 和Ikr 使用同一通道。Ikr 值的表示，通常是測定鉗制方波就要結(jié)束時的外向電流幅值；Itail 的測定是在鉗制初期上升的幅值。 內(nèi)向整流電流 (inward rectifier current, Ikir)：

38、在膜超極化時內(nèi)向整流通道開放，K流入細胞內(nèi)，當(dāng)膜電位近于靜息電位或更正時，該通道趨于關(guān)閉。一般情況下保持電位的設(shè)置與細胞的靜息電位相當(dāng)，設(shè)在 80 mV，在這個電位下，膜電位為“零”，保持電位是“零”電流電位。然后令鉗制電位從正于保持電位的方向，向超極化方向復(fù)極，超極化可達-140 mV 到 160 mV，過度超極化可能會損傷細胞，步階電壓仍為10 mV在神經(jīng)細胞，Ikir 于鉗制初期可表現(xiàn)出一個瞬間內(nèi)向電流，很快衰減，之后趨于平衡，形成時間不依賴性或稱為持續(xù)性電流。測量電流幅度是測瞬間電流峰值和持續(xù)性電流峰值。分別繪制其I-V 曲線，再做分析。 瞬間外向電流 (transient outwa

39、rd current, IA 或Ito)： 用于記錄Ito 的電壓鉗制方案與延遲整流電流的方案基本一樣，通常將保持電位設(shè)在 80 mV，但這種電壓鉗制方案在記錄到的Ito 中，一定混有Ikir。目前可用兩種方法將其分開。第一，設(shè)置兩個電壓鉗制方案，即：第一個方案中的保持電位為 80 mV，鉗制電位為 +50 mV 或更高，時間為80100ms，目的在于最大程度地記錄到Ito。第二，如用改變保持電位的方法仍不能分開Ito 和Ikir，則可用某些阻斷劑 (如E-4031、TEA 等) 阻斷Ikir，然后利用方案一記錄Ito。然而，實際上要得到較純凈的Ito 是相當(dāng)不容易的，這其中包括：在某些細胞Ito 和Ikir 對膜電位的依賴性太接近，以及到目前為止尚未有十分特異的Ikir 阻斷劑。由于TEA 這類阻斷劑的特異性差，所有應(yīng)用時要格外小心，應(yīng)使用特異性較好的阻斷劑。在K+ 通道的研究中，也可應(yīng)用斜坡 (ramp) 鉗制方案。其基本要點是膜電位斜坡除極的速度不要太快。通