植物組織培養(yǎng)學(xué)(有圖片).ppt

1、植物組織培養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn),宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院 園林教研室 楊育紅 園藝教研室 盧其能 卻志群,實(shí)驗(yàn)一 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室參觀,一、目的要求 通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生掌握如何組建植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室；同時(shí)熟悉組培中涉及的各種儀器設(shè)備和器皿用具的使用方法。,二、儀器用具 組培室內(nèi)的各種實(shí)驗(yàn)設(shè)備。 三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1介紹合理的組培室布局 2介紹實(shí)驗(yàn)設(shè)備和用具 3介紹實(shí)驗(yàn)的操作規(guī)程。 四、作業(yè) 將本此實(shí)訓(xùn)內(nèi)容整理成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 每人設(shè)計(jì)一個(gè)植物組織培養(yǎng)室的組建方案。（說(shuō)明設(shè)計(jì)思路）,超凈工作臺(tái),實(shí)驗(yàn)二 MS培養(yǎng)基母液的配制與保存,一、目的要求 通過(guò)MS培養(yǎng)基的母液配制和保存,掌握配制和保存培養(yǎng)基母液的基本

2、技能.,二、材料與用具 1 所需儀器及設(shè)備：天平、燒杯、定容瓶、量筒、蒸餾水、母液瓶、標(biāo)簽、冰箱等。 2 所需藥品及試劑：配制MS培養(yǎng)基所需的藥品、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、95%酒精、0.1mol/l的NaOH、0.1mol/l的HCl,三、方法步驟 1母液的配制 根據(jù)MS培養(yǎng)基配方表配制六種母液。（詳見(jiàn)附表） 2母液的保存 （1）裝瓶：將配制好的母液分別倒入瓶中，瓶上貼好標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、母液號(hào)、吸取量與配制日期。 （2）儲(chǔ)藏：將母液瓶?jī)?chǔ)放在冰箱內(nèi)備用。 四、作業(yè) 1整理實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 2列一張配制MS培養(yǎng)基母液成分表。,配制MS培養(yǎng)基母液成分表,實(shí)驗(yàn)三 MS固體培養(yǎng)基的配制,一 目的要求 通

3、過(guò) MS固體培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的基本技能。,二 材料與用具,1 所需儀器及設(shè)備：電爐、酸度計(jì)、高壓濕熱滅菌器 2 所需藥品及試劑：配制MS培養(yǎng)基的各種母液、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液、 0.1mol/l NaOH、0.1mol/l Hcl 、瓊脂、蔗糖、蒸餾水 3 其他材料：移液管、量筒、定容瓶、培養(yǎng)瓶、標(biāo)簽、鉛筆。,三 方法步驟,1按母液順序和規(guī)定量，用吸管提取母液，放入盛有一定量蒸餾水的量筒 母液一 20ml 母液二 10ml 母液三 10ml 母液四 10ml 母液五 20ml 母液六 5ml 2加入生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)： 適配制的培養(yǎng)基而定。 3加入蔗糖：30g/l 4加蒸餾水定容后倒入鍋中

4、5加入瓊脂：6.5g/l（視瓊脂質(zhì)量而定）,后調(diào)節(jié)PH值(用1mol/l的NaOH或1mol/l的HCL) 6.熔化瓊脂: 在電爐上加熱溶液,并不斷攪拌,使瓊脂熔化. 7.培養(yǎng)基的分裝,四、作業(yè),1整理實(shí)驗(yàn)報(bào)告 注：（1）配制培養(yǎng)基時(shí)母液吸取量的計(jì)算： 吸取量（ml）=（培養(yǎng)基中某成分的規(guī)定濃度（mg/l）*配制培養(yǎng)基的體積（l）/母液中某成分濃度（mg/l） （2）植物激素母液吸取量計(jì)算： 吸取母液量（ml）=（培養(yǎng)基中激素濃度（mg/l）*配制培養(yǎng)基體積（l）/激素母液濃度（mg/ml）,實(shí)驗(yàn)四 愈傷組織的誘導(dǎo),一、目的要求 本次試驗(yàn)，首先通過(guò)在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作訓(xùn)練，使學(xué)生初步掌握

5、組織培養(yǎng)的無(wú)菌操作技術(shù)。其次，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)是了解并掌握愈傷組織誘導(dǎo)的基本程序和方法。,二 材料與用具,1 所需儀器及工具：超凈工作臺(tái)、70%酒精、95%酒精、接種器械（主要指剪刀、鑷子等）、培養(yǎng)材料或外植體、0.1%的升汞、無(wú)菌水等。 2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+2.4-D1.0+KT0.2 或B5+2.4-D1.0+KT0.2,三、方法步驟,1進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后用水和肥皂洗凈雙手，穿上滅菌過(guò)的專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服、帽子、鞋子。 2打開(kāi)超凈工作臺(tái)內(nèi)的吹風(fēng)和紫外燈，并打開(kāi)無(wú)菌操作室內(nèi)的紫外燈，照射20分鐘（進(jìn)行紫外滅菌） 3進(jìn)行外植體預(yù)處理（即對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水

6、中沖洗干凈。） 4照射20分鐘后，關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)照明燈，用70%的酒精擦拭工作臺(tái)和雙手，準(zhǔn)備進(jìn)行外植體的消毒和接種工作。,5用蘸有70%的酒精的紗布擦拭裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，放進(jìn)工作臺(tái)。 6把接種器械浸泡在95%酒精中，在火焰上滅菌后，放在器械架上。 7胡蘿卜種子經(jīng)75%乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗2遍，再用0.1%升汞浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗3-5次后，接種于不含任何激素的1/2MS固體培養(yǎng)基含（1.5%蔗糖）上，于24暗培養(yǎng)條件下萌發(fā)7-10天后，將子葉和下胚軸切成0.5cm的截段作為組織培養(yǎng)的材料。 8.進(jìn)行接種。 9.接種完畢后,清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái),并將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。,四、作業(yè)

7、,1.整理實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 2.接種一周后,觀察接種材料的污染情況,并分析污染原因。 3.25天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率，記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。,實(shí)驗(yàn)五 月季莖段的離體培養(yǎng),一、目的要求 通過(guò)本次試驗(yàn)，熟練掌握外植體的表面滅菌方法，并鞏固掌握無(wú)菌操作的基本要領(lǐng)，重點(diǎn)掌握一般花卉的器官的離體培養(yǎng)的基本程序。,二 材料與用具,1 所需儀器及工具：超凈工作臺(tái)、70%酒精、95%酒精、接種器械（主要指剪刀、鑷子等）、培養(yǎng)材料或外植體、0.1%的升汞、無(wú)菌水等。 2 所需材料：嫩葉、嫩莖切段、頂芽或側(cè)芽 3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+2.4-D1.0mg/l+6-BA0.1mg/l 或MS+NAA0.1mg/l+6-BA0.

8、1mg/L+2.4-D0.5mg/l,三、方法步驟,1進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后用水和肥皂洗凈雙手，穿上滅菌過(guò)的專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服、帽子、鞋子。 2打開(kāi)超凈工作臺(tái)內(nèi)的吹風(fēng)和紫外燈，并打開(kāi)無(wú)菌操作室內(nèi)的紫外燈，照射20分鐘（進(jìn)行紫外滅菌） 3進(jìn)行外植體預(yù)處理（即對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。） 4照射20分鐘后，關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)照明燈，用70%的酒精擦拭工作臺(tái)和雙手，準(zhǔn)備進(jìn)行外植體的消毒和接種工作。,5 外植體消毒滅菌時(shí)，先用自來(lái)水沖洗2小時(shí)，洗去滲出汁液，再用70%的酒精消毒8-9秒后用0. 1%的升汞消毒7-8分鐘，無(wú)菌水沖洗4-5次，效果較好.接種時(shí)，用干凈濾紙吸干

9、外植體表面水分，可以明顯減少污染率和褐變率 6 接種完畢后,清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái),并將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。,四、作業(yè),1.整理實(shí)驗(yàn)報(bào)告。 2.接種一周后,觀察接種材料的污染情況,并分析污染原因。 3.25天后統(tǒng)計(jì)莖段分化率，記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。,實(shí)驗(yàn)六 花藥培養(yǎng),一、目的要求 花藥培養(yǎng)可應(yīng)用于品種育種，即單倍體育種。同時(shí)，有的植物花藥培養(yǎng)還能有效脫除母株所帶病毒，獲得無(wú)病毒苗。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)花藥培養(yǎng)技術(shù)，為今后應(yīng)用這一技術(shù)奠定基礎(chǔ)。,二、材料與用具,1.材料：草莓花蕾 2.儀器：光學(xué)顯微鏡、蓋玻片、載玻片、超凈工作臺(tái)、手術(shù)剪、接種環(huán)、槍狀鑷子、高壓滅菌器、電磁爐、培養(yǎng)瓶等。 3.試劑：70%-7

10、5%乙醇、0.1%升汞、無(wú)菌水、醋酸洋紅 醋酸洋紅的配制：將100ml 45%的冰醋酸紅置錐形瓶中煮沸，徐徐加入0.5-1g洋紅粉末（不要一次加入，以免濺沸）。繼續(xù)煮沸20min（可采用回流煮沸），冷卻備用。,三、方法步驟,1.培養(yǎng)基配制 誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+6-BA0.5mg/l+KT0.1mg/l+NAA2.0mg/l 分化培養(yǎng)基： MS+6-BA0.5mg/l+ZT2.0mg/l+NAA0.2mg/l,2.材料的選擇（即花粉發(fā)育時(shí)期的鑒定） 選擇花粉處于單核靠邊起的花藥培養(yǎng) 鑒定方法：從田間采集花蕾數(shù)個(gè)，從每花蕾取花藥1-2枚置載玻片上，加醋酸洋紅1-2滴，用玻棒頭或鑷子的一頭壓碎花藥，

11、剔除碎片，加蓋玻片鏡鑒。通過(guò)鏡鑒記錄處于單核靠邊期花藥花蕾的外觀形態(tài)，便于下次采集。通?；ㄋ巻魏丝窟吰诘牟葺ɡ傩螒B(tài)是：未開(kāi)放，花萼略長(zhǎng)于花冠或花冠剛露白，花冠白色或淡綠且不松動(dòng)，花藥微黃且充實(shí)。,3.材料預(yù)處理、消毒和接種,取花粉發(fā)育處于單核靠邊期(約4-6mm大小)的花蕾，放在4冰箱中低溫預(yù) 處理3d-5d或不經(jīng)低溫處理，用70%的乙醇表面消毒10-15s后，再經(jīng)2%的84 消毒液消毒15min，無(wú)菌水清洗3-4次，每次4-5min，用無(wú)菌試紙吸干花蕾表面水 分后，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)』ㄋ帲⒓唇臃N于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。,4.培養(yǎng)觀察 接種后暗培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。組培室內(nèi)溫度控制在20左右，

12、光照時(shí)間16h/d，光強(qiáng)1500-2000lx。,四 分析討論 1 觀察并記錄花藥的分化狀況 2 30天后，分析培養(yǎng)基對(duì)于花藥培養(yǎng)的影響,實(shí)驗(yàn)七 植物頂端分生組織培養(yǎng)脫毒,一、目的要求 通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，了解一般園林植物的組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)，并掌握頂端分生組織的分解方法,二、材料與用具,1.材料：草莓莖尖 2.儀器：光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)、手術(shù)剪、接種環(huán)、槍狀鑷子、高壓滅菌器、電磁爐、培養(yǎng)瓶等。 3.試劑：70%-75%乙醇、0.1%升汞、無(wú)菌水,三、方法步驟,1.培養(yǎng)基配制 誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+6-BA0.5mg/l+KT0.1mg/l+NAA2.0mg/l 分化培養(yǎng)基： MS+6-BA0.5mg/l+ZT2.0mg/l+NAA0.2mg/l,2打開(kāi)超凈工作臺(tái)內(nèi)的吹風(fēng)和紫外燈，并打開(kāi)無(wú)菌操作室內(nèi)的紫外燈，照射20分鐘（進(jìn)行紫外滅菌） 3進(jìn)行外植體預(yù)處理（即對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。） 4照射20分鐘后，關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)照明燈，用7