病毒滴度測定

1、.可以采用倍比稀釋來測定病毒的滴度。第一個Ep管中加入10uL病毒原液，記為1E+1 uL ；第二個Ep管中進(jìn)行了第一次十倍稀釋，所得病毒原液為第一個Ep中的1/10，記為1E+0 uL；第三個Ep管中進(jìn)行了第二次十倍稀釋，所得病毒原液為第二個Ep中的1/10，記為1E-1 uL ；依次類推第七個Ep管中進(jìn)行了第六次十倍稀釋，所得病毒原液為第六個Ep中的1/10，記為1E-5 uL ；第八個Ep管中進(jìn)行了第七次十倍稀釋，所得病毒原液為第七個Ep中的1/10，記為1E-6 uL ；換句話說：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中觀察到3個帶有熒光的細(xì)胞，說明該孔中至少有3個病毒顆粒感染了細(xì)胞，

2、則該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，單位為TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。稀釋計數(shù)法滴度單位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。TU為transducing units的縮寫，中文為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位，表示可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。第一天 細(xì)胞準(zhǔn)備將生長狀態(tài)良好的 293 T 細(xì)胞消化計數(shù)后稀釋至 1100 000/mL，加入 96 孔板，100 L/孔，為每個病毒準(zhǔn)備 10 個孔。放入 37，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀釋，連續(xù) 10 個稀釋度。稀釋方法如

3、下：每種病毒準(zhǔn)備 10 個 1.5mL EP 管，每管加入 90 L 培養(yǎng)液，往第一個管中加入 10 L 病毒原液，混勻后，吸取 10 L 加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（100.00000001）。吸取 96 孔板中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。第三天 追加培養(yǎng)液在每個孔再加入 100 L 完全培養(yǎng)液，利于細(xì)胞的生長。第四天 觀察結(jié)果并計算滴度在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為 X 和 Y，則滴度（TU/mL）=（X+Y10）1000/2/X 孔的病毒液的含量（L）。定量 PCR 法病毒感染 1 天前，取 6 孔板接種 HOS 細(xì)

4、胞。每孔細(xì)胞為 5100 000 個。接種細(xì)胞 24 小時后，取兩個孔的細(xì)胞用血球計數(shù)板計數(shù)，確定感染時細(xì)胞的實際數(shù)目，記為 N。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有 5 g/mL polybrene 的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋 200 倍，也就是取 1 L 病毒加入到 199 L 的培養(yǎng)基中。在 3 個培養(yǎng)孔中分別加入 0.5 L，5 L 和 50 L 的稀釋病毒。感染開始后 20 小時，除去培養(yǎng)上清，換為 500 L 含 DNaseI 的新鮮培養(yǎng)基。在 37 消化 15 分鐘，這一步是要除去殘余的質(zhì)粒 DNA。然后換為 2 mL 正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 小時。用 0.5 m

5、L 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化細(xì)胞，在 37 放置 1 分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細(xì)胞。按照 DNeasy 試劑盒的說明抽提基因組 DNA 。每個樣品管中加入 200 L 洗脫液洗下 DNA 。用 DNA 定量試劑盒定量（Bio-Rad）?；蚪M DNA 可以穩(wěn)定保存在 -20 至少兩個月。準(zhǔn)備 PCR 所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管 ：Forward primer （100 pmol/mL）：0.1L nReverse primer （100 pmol/mL）：0.1L nProbe （100 pmol/mL)：0.1L n水：19.7 L nn = number

6、of reactions。例如：總反應(yīng)數(shù)為 40，將 1 mL 2 TaqMan Universal PCR Master Mix，4 L forward primer，4 L reverse primer，4 L probe 和 788 L 水混和。震蕩后放在冰上。2 TaqMan Master Mix：25 L n10RNaseP primer/probe mix：2.5 L n水：17.5 L nn = number of reactions。例如：總反應(yīng)數(shù)為 40，將 1 mL 2 TaqMan Universal PCR Master Mix，100 L 10RNaseP prime

7、r/probe mix 和 700 L 水混和。震蕩后放在冰上。在預(yù)冷的 96 孔 PCR 板上完成 PCR 體系建立。從總管 中各取 45 L 加入到 A-D 各行的孔中，從總管 中各取 45 L 加入到 E-G 各行的孔中。分別取 5 L 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組DNA 加入到 A-D 行中，每個樣品重復(fù) 1 次。另留 1 個孔加入 5 L 的水做為無模板對照（no-template control）。分別取 5 L 基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組 DNA 加入到 E-G 行中，每個樣品重復(fù) 1 次。另留 1 個孔加入 5 L 的水做為無模板對照（no-template control）。

8、所使用定量 PCR 儀為 ABI PRISM 7000 定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50 2 分鐘，95 10 分鐘，然后是 95 15 秒，60 1 分鐘的 40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測得的 DNA 樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度（integration units per mL，IU/mL）的計算公式如下：IU/mL= (C N D1000)/V其中：C = 平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)；N = 感染時細(xì)胞的數(shù)目（約為 1100000）D = 病毒載體的稀釋倍數(shù) ；V = 加入的稀釋病毒的體積數(shù)。96孔板病毒滴定實驗方法總結(jié)一看了前面一個關(guān)于

9、病毒滴定方法的帖子,自己也做過不少次,所以想寫出一點兒,算是個總結(jié),希望能對各位有所幫助.這里我寫2種方法,一種是在稀釋好的病毒液里加細(xì)胞懸液.另一種是在長成單層的細(xì)胞上,加入已經(jīng)稀釋好的病毒液.這兩種方法我都做過,效果各有長處.1.一個確定的地方是,所用細(xì)胞是貼壁生長,所以在維持液或者生長液中都不能加入胰酶,這一點和流感病毒病毒滴定測定有很大不同;2.稀釋液配方:MEM(或DMEM)+1%雙抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值確定,一般以加到pH7.0為主,可用pH試紙測定,NaHCO3的濃度為6%).另,MEM,或DMEM的選擇由所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞決定;3.細(xì)胞懸液為細(xì)胞+生長液(MEM+

10、10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%雙抗+NaHCO3).在加細(xì)胞懸液的病毒滴定測定方法中,如果不加入細(xì)胞生長液,則細(xì)胞無法貼壁;方法一.在稀釋好的病毒液中加入細(xì)胞懸液:1.一個確定的地方是,所用細(xì)胞是貼壁生長,所以在維持液或者生長液中都不能加入姨酶,這一天和流感病毒病毒滴定測定有很大不同;2.稀釋液配方:MEM(或DMEM)+1%雙抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值確定,一般以加到pH7.0為主,可用pH試紙測定,NaHCO3的濃度為6%).另,MEM,或DMEM的選擇由所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞決定;3.細(xì)胞懸液為細(xì)胞+生長液:MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%雙抗+NaHCO3加細(xì)胞懸液

11、的病毒滴定測定方法中,如果不加入細(xì)胞生長液,則細(xì)胞無法貼壁;4.96孔板上做10倍稀釋病毒,從10-1開始,一般做5-6個稀釋度,即到10-5或10-6即可,每孔25微升,每個稀釋度做4孔,或者8孔,一般做4孔即可;5.消化細(xì)胞,并用生長液反復(fù)吹打細(xì)胞,使細(xì)胞充分混允,放入雙碟,用排槍將細(xì)胞懸液加入相應(yīng)孔中,每孔100微升;6.細(xì)胞對照孔:125微升細(xì)胞懸液,不加病毒;7.關(guān)于96孔板,每孔接種的細(xì)胞量:一般在此種測定病毒滴度的方法下,要將細(xì)胞密度適當(dāng)調(diào)低,至少要比正常傳代時低一些,否則細(xì)胞生長速度過快,未到7天則細(xì)胞出現(xiàn)死亡,對觀察CPE不利.一般情況下,小塑料瓶(8-9ml液體為正常用量)

12、,培養(yǎng)長慢單層后,消化細(xì)胞,加入6ml培養(yǎng)液,吹勻,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在該瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用顯微鏡看一下,細(xì)胞數(shù)過多則補(bǔ)加培養(yǎng)液,少則補(bǔ)加剩余4ml的細(xì)胞懸液;8.37oC, 5CO2培養(yǎng)7天左右,每天觀察結(jié)果,從出現(xiàn)CPE的第一天開始記錄,一般第7天可以計算病毒滴度;9.計算公式,比較復(fù)雜,明天再附上,這里介紹一個簡單的計算TCID50的方法:由以上公式求得 0.6 加到僅高於 50感染率稀釋指數(shù) ( 此例中為10-3 )得10-3.6即為病毒作10-3.6稀釋後每 0.1ml 含 1 TCIP50，亦即該病毒之力價為 10-3.6/0.1ml。這里

13、是以每個稀釋度8孔為例,如果做的是4孔一個稀釋度,則對應(yīng)的換一下數(shù)字即可.(這里是轉(zhuǎn)自別人的帖子,但是我用了之后覺得比那個很長的公式容易得多,所以推薦給大家)10.本方法的優(yōu)點:不容易污染;缺點: .細(xì)胞生長周期長,出結(jié)果所需時間也長,一般要到第7天才能計算病毒滴度;. 病毒本身有毒性,所以對細(xì)胞的貼壁造成一定影響,這也是此法中細(xì)胞生長慢的原因之一;. 不容易控制細(xì)胞數(shù)量,需要經(jīng)驗,一旦細(xì)胞數(shù)量過多,則不到第7天細(xì)胞大量死亡,無法判斷CPE;若細(xì)胞數(shù)量過少,則細(xì)胞無法正常生長,不能正常增殖,也是造成無法判斷CPE的原因之一;還有另外一種方法,明天再寫.如果有什么不恰當(dāng)?shù)牡胤?希望有經(jīng)驗的高手多多指教,希望大家能多多交流,謝謝!4.維持液,即病毒培養(yǎng)液