多糖各種提取方法.docx

1、一、植物多糖的提取1 溶劑提取法 11 水提法水對植物組織的穿透力強，提取效率高，在生產(chǎn)上使用安全、經(jīng)濟。用水作溶劑來提取多糖時，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用熱水浸提法，該法所得多糖提取液可直接或離心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，沉淀提純多糖；但由于不同性質(zhì)或不同相對分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇濃度不同，它也可以用于樣品中不同多糖組分的分級分離；還可按多糖不同性質(zhì)在粗分階段利用混合溶劑提取法對植物中不同的多糖進行分離；其中，以乙醇沉淀最為普遍。但以根莖為主的植物體,細胞壁多糖含量高,熱水直接提取率不高。此時為破壞細胞壁,增加多糖的溶出，有兩種處理方

2、法:一為酶解,二為弱堿溶解。12酸堿提法有些多糖適合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢，目前報道的并不多。而且即使有優(yōu)勢，在操作上還應嚴格控制酸度，因為酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀堿多位為01molL氫氧化鈉、氫氧化鉀，為防止多糖降解，常通以氮氣或加入硼氫化鈉或硼氫化鉀。同樣，堿提優(yōu)勢也是因多糖類的不同而異。與酸提類似，堿提中堿的濃度也應得到有效控制，因為有些多糖在堿性較強時會水解。另外，稀酸、稀堿提取液應迅速中和或迅速透析，濃縮與醇析而獲得多糖沉淀。14 生物

3、酶提取法 酶技術是近年來廣泛應用到有效成份提取中的一項生物技術，在多糖的提取過程中，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等的產(chǎn)物，常用的酶有蛋白酶，纖維素酶，果膠酶等。15 超聲提取法超聲波是一種高頻率的機械波，其主要原理是利用超聲波產(chǎn)生的“空化作用”對細胞膜的破壞，有利用植物有效成分的釋放，而且超聲波能形成強大的沖擊波或高速射流，有效地減小、消除與水相之間的阻滯層，加大了傳質(zhì)效率，有助于溶質(zhì)的擴散。另外，超聲波的熱效應使水溫基本在57，對原料有水浴作用。超聲波提取與傳統(tǒng)的提取方法相比，有提取效率高、時間短、

4、耗能低等優(yōu)點。超聲提取的影響因素有：超聲時間、超聲頻率（一般低頻中提取效率高，但也有例外）、料液比和溫度等。16 微波提取微波是頻率介于300MHz和300GHz之間的非電離電磁波，微波提取的原理是微射線輻射于溶劑并透過細胞壁到達細胞內(nèi)部，由于溶劑及細胞液吸收微波能 細胞內(nèi)部溫度升高，壓力增大，當壓力超過細胞壁的承受能力時，細胞壁破裂，位于細胞內(nèi)部的有效成份從細胞中釋放出來，傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周圍被溶劑溶解。微波技術應用于植物細胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點。影響微波浸提的主要因素為浸提時間、樣品和提取溶劑的含水量，溶劑的介電常數(shù)和電導率（介電常數(shù)和電導率的溶劑

5、對微波的吸收較好）、微波功率等。但是由于微波泄漏對操作者影響很大，因而對設備的要求較高，這對微波的研究及應用帶來了一定的困難。 二、植物多糖的分離純化 在多糖提取物中，常會有無機鹽、蛋白質(zhì)、色素及小分子物質(zhì)等雜質(zhì)，必須分別除去一般是先脫除非多糖組分，再對多糖組分進行分級21 除蛋白除蛋白質(zhì)時一般選擇能使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質(zhì)的目的仍需反復處理。如能加入蛋白質(zhì)水解酶，使蛋白質(zhì)大分子進行一定程度的降解，再用Sevage

6、法處理，一般效果更好。為了避免使用有機溶劑也可采用反復凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮后，一20室溫反復凍融78次，離心除去蛋白質(zhì)。另外，蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調(diào)pH10pH11可除去偏堿性的蛋白質(zhì)，然后再用硫酸調(diào)pH5pH6，可除去偏酸性的蛋白質(zhì)。凍融和等電點沉淀除蛋白質(zhì)操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質(zhì)殘留，應與其它方法結(jié)合使用。 22 脫色植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除?；钚蕴勘缺砻娣e大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了01左右的活

7、性炭，煮沸后濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。23 除小分子雜質(zhì)小分子雜質(zhì)如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統(tǒng)的方法是透析法，該法操作簡單、技術成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術的發(fā)展，纖維濾器透析法已經(jīng)發(fā)展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產(chǎn)周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質(zhì)的一條新途徑。24 多糖的分級純化采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級

8、(如分級沉淀、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質(zhì)分級241按溶解性不同分離2.4.1.1分步沉淀法分步沉淀法是根據(jù)不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質(zhì)，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉淀2.4.1.2 鹽析法鹽析法是根據(jù)不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。2.4.2 按電離性質(zhì)不同分離2.4.2.1季胺鹽沉淀法季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡合物，此絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產(chǎn)生沉淀。若提高多糖液pH值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉淀分離

9、。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。243 柱層析法 2.4.3.1凝膠柱層析法凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。2.4.3.2纖維素陰離子交換劑柱層析法纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和堿型兩種，洗脫劑可用不同濃度堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優(yōu)點可吸附雜質(zhì)、純化多糖，并適用于分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。2

10、.4.3.3 活性炭柱層析法活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質(zhì)的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱后先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。2.4.3.4 離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯(lián)用法 有些植物的多糖成分復雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質(zhì)的色譜柱聯(lián)用才能得到單一多糖組分。2.4.3.5 三種層析柱聯(lián)用 采用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯(lián)用，即先進行DEAESephadexA柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用SephacrylS柱層析，得到主要組分再用SephadexG一100柱層析，有時會有較高的得率。 三、多糖的純度鑒定 經(jīng)過分級純化的多糖在測定結(jié)構(gòu)前須進行純度鑒定而且多糖的純度不能用通?；衔锏募兌葮藴蕘砗饬?，因為即便是多糖純品，其微觀也并不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，通常所謂的多糖純品也只是一定相對分子質(zhì)量范圍的多糖的均一組分目前常用于多糖純度的鑒定方法有：高效液相、 凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等 四、常見問題多糖制備過程中蛋白質(zhì)的脫除是目前分離純化多糖的難點。Sevag法需要消耗大量的有機溶