單底物酶促反應(yīng)

1、第一節(jié)動力學(xué)方程推導(dǎo)酶反應(yīng)的基本動力學(xué)關(guān)系，是指酶反應(yīng)速度 與酶和底物間的動力學(xué)關(guān)系。因?yàn)槊负偷孜锸?構(gòu)成酶反應(yīng)系統(tǒng)最基本的因素，它們決定酶反 應(yīng)的基本性質(zhì)、酶反應(yīng)的速度規(guī)律，而其他各 種因素也正是通過它們產(chǎn)生影響的；而且，這 前動另學(xué)關(guān)系是整個酶反應(yīng)動力學(xué)的基礎(chǔ)。描寫這種基本動力學(xué)關(guān)系的是米氏方程 (Michaelis-Menten equation)。V = vmaxS / (Km+S)酶促反應(yīng)速度的測定與酶的活力單位1、測定酶促反應(yīng)的速度必需測初速度2、酶活力檢測酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來表示酶量， 即用酶的活力表示。酶

2、催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件 下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。3、酶活力的表示方法4、酶活力測定方法：終點(diǎn)法動力學(xué)法酶活力測定方法終點(diǎn)法：酶反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后終止其反應(yīng),再用化學(xué)或物理方法測定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。動力學(xué)法:連續(xù)測定反應(yīng)過程中產(chǎn)物底物或輔酶的變化量，直接測定出酶反應(yīng)的初速度。酶活力的表示方法活力單位(active unit) 量度酶催化能力大小習(xí)慣單位（u）:底物（或產(chǎn)物）變化量/單位時(shí)間國際單位（IU） : lymoL變化量/分鐘Ratal （Kat） : lmoL變化量/秒比活力(specific activity )量度酶純度比活力=總活力單位

3、總蛋白mg數(shù)=U(或IU) mg蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 量度轉(zhuǎn)換效率底物（ymoL） /秒每個酶分子各種因素對酶反應(yīng)速度的影響1、酶濃度當(dāng)S足夠過量，其它條件固定且無不利因素時(shí)，v=kE2、底物濃度3、pH:適pH的概念）4、溫度（最適溫度的概念）III5、激活劑6、抑制劑底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線（Michaelis一Menten 曲線）米氏方程的提出及推導(dǎo) 米氏常數(shù)的意義 米氏常數(shù)的測定單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及E + S 匕 “ ES _J米氏方程:KnaxMKm+S“ k A + 米氏常數(shù)：Km =亠推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照“穩(wěn)態(tài)平衡”假

4、說的設(shè)想進(jìn)行推導(dǎo)。Substrate concentration SX a(A) A100-9A uoeeH酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系曲線kJS + E ES _P + Ese,-ES_1S1ES生成速度：片二心（耳_ES）S , ES分解速度：v2k_ES+kXES米氏方程的推導(dǎo)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：V, = v2即：和呵-劇嗣*血+刊閉 - 也髦嚴(yán)1=丁 令：k_x +K =Kmk、經(jīng)整理得：ES心+由于酶促反應(yīng)速度由ES決定，v將(2)代入(1)得：=*2ES則：k,”es+ess=esESJ即v = k2ES，所以0s=產(chǎn)AC?呵S十業(yè)羈A 心+ S心 + s當(dāng)Et二ES時(shí)，v =

5、V將(4)代入(3),貝!所以匕=*2國吆 axS第二節(jié)米氏方程的討論一、米氏方程的特性二、米氏方程中卩和S的關(guān)系當(dāng)v=Vmax時(shí),V與S無關(guān),只和E。成正比,這時(shí) 表明酶的活性部分已全部被底物占據(jù)。當(dāng)v=0.5Vmax時(shí), 表示活性部位有一半被占據(jù)。當(dāng)一個酶的已知，則 任何底物濃度下酶活性部位被占據(jù)的分?jǐn)?shù)：VSY s VmaxKm+S稱為該酶促反應(yīng)的相對速度。米氏方程所作曲線的曲度，不隨的 變化而變化。所以任何酶只要服從米氏方程。貝U 到達(dá)任何兩個vm分?jǐn)?shù)的對應(yīng)底物濃度之比為一 常數(shù)。例如：0.9 Vmax _ S0.9Vax _ Km+S0.9S.9 =9 Km,同理（S/o./ =1/9

6、 Km,所以：S0_9/S0J = 9Kn/l/9Km =81,即達(dá)90%Vmax與達(dá) %Vmax所需底物濃度之比總是刃。同樣也可得到達(dá)70% 匕皿與達(dá)匕遠(yuǎn)所需底物濃度之比總是2人在酶促反應(yīng)初速度區(qū)即在一級速度區(qū),由于Q/vvK沖,A v=VmaxS/Km=kSo從這個方程可知，一級速度常數(shù) = % /心O的物理意義：底物在單位時(shí)間轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的量。 例如Z：=0.02min1,就意味著底物在一分鐘內(nèi)會 有?轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物；若=2.3miiyi=0.0383sec J , 那就意味著每秒鐘有3.83 %的底物變成產(chǎn)物。 要測定任一時(shí)間范圍內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的 生成量，可用一級速度方程積分。得：lg

7、S=-Zrt/2.3+ lgSt一級速度方程lg S對t作圖第三節(jié)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析酶促反應(yīng)速度的作圖法、Lineweaver-Burk法（雙倒數(shù)作圖法）*想吒將實(shí)驗(yàn)所得的一些初速度數(shù)據(jù)v和S取倒數(shù)，得各種 1/v和1/S,將1/v對1/作圖，得一直線。該直線縱 截距= 1/Vmax，斜率=Km/Vmax,橫截距二 1/Kmo 應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求KnHVmax等動力學(xué) 常數(shù)比較方便，也是最廣泛應(yīng)用的一種方法，但欲要 獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須注意底物濃度范圍， 一般所選底物濃度需在1Woolf-Augustinsson-Hofstee 作圖法3.Eadie-Scatchard 作

8、圖法將米氏方程重排為線性方程以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使S比 Kg高得多或低得多。上述幾種線性作圖法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。雙倒數(shù)作圖 法應(yīng)用最廣泛。但此法有兩個缺點(diǎn)：第一，在S 圖上，由相等增值而給岀的等距離各點(diǎn)，在雙倒數(shù)圖 上變成非等距離的點(diǎn)，且多數(shù)點(diǎn)集中在1/卩軸附近，而 遠(yuǎn)離1/卩軸的地方只有少數(shù)幾個點(diǎn)，恰好這些點(diǎn)又正是 主觀目測以確定直線最權(quán)重的那些點(diǎn)。第二，在測定 時(shí)產(chǎn)生的小誤差，當(dāng)取倒數(shù)時(shí)會放大。在低底物濃度 下更為敏感，因在高1/S值所得的一兩個不準(zhǔn)確的點(diǎn), 會給圖的斜率帶來顯著誤差。第一個缺點(diǎn)可通過選擇 適當(dāng)?shù)腟,使1/S為等距離增值而得到克服。對第二 個缺點(diǎn)關(guān)鍵要注意在

9、低底物濃度下使所測初速度誤差 盡可能減小。四、米氏方程的積分形式及其對數(shù)據(jù)的處理米氏方程是一個微分方程，其v=dP/dt或v=dS/dt。根 據(jù)從米氏方程重排得到的線性方程作圖求和Vmax時(shí)， 在實(shí)驗(yàn)過程中所取數(shù)據(jù)必須限于初速度階段，即只能是 小于5%的SJ轉(zhuǎn)變?yōu)镻的階段。但有些情況，例如，產(chǎn) 物濃度過低難以測定；或產(chǎn)物根本不能直接測定，而必 須測定底物濃度的降低來反映產(chǎn)物的量(即P = St-S)o 若只限于5 %的底物發(fā)生反應(yīng)就難以測準(zhǔn)其降低的量。在這些情況下，如用積分速度方程處理，就不受這種限 制。例如，在10%90%的SJ轉(zhuǎn)變?yōu)镻的數(shù)據(jù)均可使 用。因?yàn)榉e分方程在反應(yīng)全過程中都是準(zhǔn)確的。

10、最簡單 的積分方程是在假定無產(chǎn)物抑制(BPKmsKmp),并且 Keq很大的情況下導(dǎo)出：J：；違嚴(yán)d S kJ：J品一總SVir4Xt= KMpCS St) =2- 3KmlgCSi3 S孕g(shù)gj芒甲+蛙計(jì)埠舉+走重排成各種線性形式，如t米氏積分方程的一種作圖法可直 gWiVmax/Km 和 Jax， 從而可算出K”這樣的處理方 法，可從比大幾倍的SJ (如 St =10Km)開始，將反應(yīng)進(jìn)行 到S顯著低于(如=0.1 Km) 止。五、Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對數(shù)據(jù)的處理改良的雙倒數(shù)方程形式與雙倒數(shù)方程相似，為R芒嘀+出其中K甲4嚴(yán) 是t這一段時(shí)間內(nèi)的平均速度；幻國 + S為反應(yīng)過程

11、中底物濃度的算術(shù)平均值。由于積分方程對任何反應(yīng)程度的數(shù)據(jù)處理都是準(zhǔn)確的對比:% d CS=號= o5231g 加 邸 一 SR=從以上計(jì)算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，即使反應(yīng)已進(jìn)行到30%,所引入的誤 差也不過1%左右。很明顯，如果所有酶是飽和的，而且反應(yīng)顯著不可 逆，而且沒有產(chǎn)物抑制的情況，用改良雙倒數(shù)法處理實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)來測定Kg和Vx，可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。如有必要， 可用捕獲劑或偶聯(lián)酶使產(chǎn)物不斷移去，迫使反應(yīng)不可逆, 并使產(chǎn)物抑制成為最小。第四節(jié)酶的分析和檢測一、酶促反應(yīng)初速度隨EJ的變化酶促反應(yīng)的初速度隨EJ的變化而變化。通常在離體測 定條件下，印一般為10-1210-

12、7 mol/L,而S為10- 6 iCPmol/L?？蓪⒚资螮洱+1這樣，當(dāng)S為常數(shù)時(shí)，則初速度”與EJ成正比。但一個 酶促反應(yīng)速度，常因S的改變而改變。因此反應(yīng)時(shí)間必 須盡可能短，使S幾乎處于恒態(tài)（即只有5%以下的底物 形成產(chǎn)物），才能得到真正的初速度，卩與EJ之間的關(guān)系 才會是線性的。二、酶活力單位和比活力 ID是指酶在一定作用條件下，單位時(shí)間內(nèi)，使底物 轉(zhuǎn)化的量或產(chǎn)物生成的量。也就是說，酶量的多少是 采用其催化能力來度量；換句話說，是采用酶催化反 應(yīng)的速度來度量，因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)臈l件下，叱E。為了使酶單位的文獻(xiàn)報(bào)道能統(tǒng)一，并具有可比性， 國際酶學(xué)會議曾制訂了一個標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下, 1分

13、鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物所需的酶量為一個酶單位。 所謂特定條件，溫度定為25C, pH、底物濃度等其它 條件均定為最適條件。該酶單位稱為國際單位IU)。酶制劑中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。 酶的比活力(specific activity)是指每毫克蛋白中所 含的酶單位數(shù)，用U/mg蛋白表示。三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)m IV轉(zhuǎn)換數(shù)可用兩種方法表示。其一是以分子活tt(molecular activity)來定義，即在最適條件下、每摩爾酶每分鐘所轉(zhuǎn) 變的底物摩爾數(shù)(即每微摩爾酶的酶單位數(shù))。其二是許 多酶為寡聚體。含幾個亞基，因此可用另一種方式來表 示轉(zhuǎn)換數(shù)，即在最適條件下，每摩爾活性亞基或催化中 心每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)。這兩個值有時(shí)簡單以 minH表示，即：知=旳=行跡科=血酶的$值約在50107miiri。碳酸酉干酶是己知轉(zhuǎn)換數(shù)最 高的陥之一(36X106miiyi)。1/冷二1.7sec,即該酶一個 催化周期為17微秒。第五節(jié)酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)一、快反應(yīng)技術(shù)酶促反應(yīng)動力學(xué)研究有兩條途徑:一是穩(wěn)態(tài)動力學(xué)。它是監(jiān)測整個反應(yīng)，得到關(guān)于反應(yīng)的籠統(tǒng)信息。二是穩(wěn)態(tài) 前動力學(xué)，它能更直接地研究整個反應(yīng)中的基本步驟或 部分反應(yīng)，提供可